朱春艷，王家軍，薛中儀，劉張淮，張熒熒

（寶應縣水生動物疫病預防控制中心，江蘇 寶應 225800）

近年來，鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病（ISKN）給鱖魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重損失。中山大學何建國等證實了鱖魚的傳染性脾腎壞死病病原為傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV），屬于虹彩病毒。ISKNV感染鱖魚脾、腎、肝、鰓、心臟和消化道等組織器官，其中，脾和腎是其主要感染器官[1-2]。一般被ISKNV感染的發(fā)病魚常表現(xiàn)為游泳異常的癥狀，鰓絲失血發(fā)白，肝臟呈黃色或淺白色，有出血點；腎臟腫大充血；脾臟充血，部分伴有出血等現(xiàn)象。由于水生動物病毒類疾病目前尚無特效治療藥物[3]，因此在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中對病原的早期診斷和及早處理帶毒動物體等生產(chǎn)資料對科學養(yǎng)殖指導工作有著重要的意義。

目前，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布實施了SC/T 7211-2011《傳染性脾腎壞死病毒檢測方法》行業(yè)標準，在生產(chǎn)中也已經(jīng)廣泛應用。但行業(yè)標準中完成DNA提取和PCR檢測的方法耗時較長。該實驗室在集成DNA快速提取技術(shù)、快速PCR技術(shù)基礎上，建立了一種簡便快速的PCR檢測法，能在3 h內(nèi)完成組織DNA提取、PCR擴增、電泳、凝膠成像，得出檢測結(jié)果，更大程度滿足漁業(yè)生產(chǎn)需求，尤其適用于縣級水產(chǎn)疫病防控實驗室。該方法該試驗在鱖魚傳染性脾腎壞死病毒快速檢測方面已有初步驗證。為進一步驗證該快速檢測方法的靈敏性，該實驗室開展了快速檢測方法的靈敏性比較的實驗，現(xiàn)將試驗過程及結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

DK-8D型水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司生產(chǎn)）；MIKRO200R型臺式高速冷凍離心機（德國Hettich公司生產(chǎn)）；S1000型PCR儀（美國B10-RAD公司生產(chǎn)）；BG-Power600型電泳儀（北京萬向旭通科技有限公司生產(chǎn)）；INFINITY-3026型凝膠成像系統(tǒng)（法國VILBER公司生產(chǎn)）。

1.2 試劑

Chelex-100%（sigma-aldrich公司生產(chǎn)）；proteaseK、2KDNAMarker、滅菌雙蒸水和 2*EasyTayPCR SuperMix（均為北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、DNA提取試劑盒（Code No.9765，TaKaRa公司生產(chǎn)）。

1.3 檢測樣品

發(fā)病塘口采集的瀕死發(fā)病鱖魚（具有典型傳染性脾腎壞死病癥狀且經(jīng)過電鏡和PCR雙重確認感染ISKNV）3尾，取魚的腎、脾組織2 g加2 mL PBS冰浴研磨。用PBS分別稀釋101~109倍。分別取100 μL不同濃度的稀釋液作為待檢樣品；陽性對照為研磨原液；陰性對照為從未受ISKNV感染的鱖魚，且電鏡和PCR雙重檢測確認ISKNV陰性的魚腎臟組織研磨液。

1.4 樣品DNA提取

1.4.1 Chelex-100法[6]各取100μL待檢樣品、陽性對照、陰性陰性對照分別置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入200 μL 5%Chelex-100懸濁液和20μL蛋白酶K，混勻10 s，56℃水浴20 min，混勻10 s，99℃水浴8 min，4℃環(huán)境下12 000 rpm離心4 min，上清液即為DNA溶液，需耗時約40 min。

1.4.2 試劑盒法 各取100μL待檢樣品、陽性對照、陰性陰性對照置于1.5mL離心管內(nèi)，加入180μLBuffer GL、20μL Proteinase K 和 10 μL RNase A（10 mg/mL），于56℃水浴2 h至組織完全裂解（難裂解的適當延長裂解時間，裂解之后先12 000 rpm離心2 min，去除雜質(zhì)之后再進行后續(xù)操作）。向裂解液中加入200μL Buffer GB 和 200 μL 100%乙醇，充分吸打混勻。將Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 rpm離心2 min，棄濾液。將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中12 000 rpm離心1 min，棄濾液。將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 rpm離心1min，棄濾液。重復加Buffer WB1次，棄濾液。將Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 rpm離心2 min。將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在 Spin Column膜的中央處加入 50～200 μL Elution Buffer（水浴至 65℃），室溫靜置 5 min。12 000 rpm離心2 min洗脫DNA。洗脫液即為DNA溶液。耗時約3 h。

1.5 PCR反應

1.5.1 快速PCR法 參考文獻[4]設計和合成引物：ISKNV-FOR（5’-GCATGTATGCTGTTTAGACA-3’）和 ISKNV-REV（5’-AGCATCAAGCAGGCGATCTG-3’），擴增真鯛虹彩病毒（RSBV）核苷酸還原酶小亞單位（RNRS）基因187 bp片段。

總反應體系 25 μL，其中包含：模板 DNA 1 μL，2×EasyTayPCRSuperMix12.5μL，正反引物各1μL，滅菌雙蒸水 9.5 μL。

PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。需耗時約1 h。

1.5.2 標準PCR法[5]參考傳染性脾腎壞死病毒檢測方法（SC/T7211-2011）合成引物：ISKNV-F2（5’-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3’）和 ISKNV-R2（5’-AGGGTGACGGTCGATATG-3’），擴增ISKNV主衣殼蛋白（MCP）基因562 bp片段。

總反應體系 50 μL，其中包含：模板 DNA 2.5 μL，2×*EasyTay PCR SuperMix 25 μL，正反引物各 1 μL，滅菌雙蒸水 20.5 μL。

PCR反應程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s、61℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保溫。需耗時約1 h 40 min。

1.6 電泳與凝膠成像檢測

取6 μL反應液在1%瓊脂糖凝膠上電泳，110 V，電泳25 min。取電泳后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)，根據(jù)UV 254 nm下觀察187 bp的DNA條帶和562的DNA條帶的有無判斷檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

用Chelex-100法提取模板快速PCR法擴增結(jié)果顯示當病毒組織原液稀釋103倍PCR擴增結(jié)果仍為陽性，模板稀釋104倍PCR擴增結(jié)果則為陰性（圖1）。

圖1 Chelex-100法提DNA，快速PCR法擴增結(jié)果

用Chelex-100法提取模板標準PCR法擴增結(jié)果顯示當病毒組織原液稀釋102倍PCR擴增結(jié)果仍為陽性，模板稀釋103倍PCR擴增結(jié)果則為陰性（圖2）。

用試劑盒法提取模板快速PCR法擴增結(jié)果顯示當病毒組織原液稀釋107倍PCR擴增結(jié)果仍為陽性，模板稀釋108倍PCR擴增結(jié)果則為陰性（圖3）。

用試劑盒法提取模板標準PCR法擴增結(jié)果顯示當病毒組織原液稀釋105倍PCR擴增結(jié)果仍為陽性，模板稀釋106倍PCR擴增結(jié)果則為陰性（圖4）。

3 討論

經(jīng)比較，相同試驗條件下快速PCR法與標準PCR法相比不僅減少了擴增時間，且擴增效果較好。

圖2 Chelex-100法提DNA，標準PCR法擴增結(jié)果

圖3 試劑盒法提DNA，快速PCR法擴增結(jié)果

圖4 試劑盒法提DNA，標準PCR法擴增結(jié)果

文中靈敏性試驗結(jié)果顯示Chelex-100法的提取效率沒有商品試劑盒的提取效率高，可能因為Chelex-100法制得的DNA粗提液溶解液較多約320 μL；而試劑盒法制得的DNA粗提液溶解液僅為80 μL，即使DNA含量相同，在作為模版擴增時吸取相同體積的DNA提取液，Chelex-100法的DNA含量較少，故檢測靈敏性相較于試劑盒法較低。如何提高Chelex-100法DNA提取效率，有待進一步探索。Chelex-100法雖然目標DNA提取效率沒有商品試劑盒法高，但是該法具有簡單快速、清潔無毒、檢材用量少等特點[6-8]，在實際運用中也存在一定的優(yōu)勢。在發(fā)病塘口（當病毒含量達到一定含量）快速診斷時Chelex-100法更加快速便捷且檢出效果較好。但在鱖魚苗種快速檢疫中，建議使用試劑盒法提取DNA結(jié)合快速PCR法檢測，以防漏檢。