謝宇鋒,余云進(jìn),楊錦蘭,陳 赟,馮 軍△,楊宗保
(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東 深圳 518000;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510000;3.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,福建 廈門(mén) 361005)
胃熱證以胃脘灼痛、燒心為主要癥狀,是胃脘痛的常見(jiàn)證型之一。胃熱證主要是飲食不節(jié)如嗜食辛辣、飲酒過(guò)度等,而致胃氣壅滯,熱毒內(nèi)蘊(yùn),熱毒之邪易于造成胃絡(luò)損傷、氣血凝滯,繼而血敗肉腐,發(fā)為糜爛潰瘍。有相關(guān)的研究表明,胃熱證、無(wú)明顯寒熱證、胃寒證胃病患者胃黏膜炎癥程度依次減輕[1]。因此,胃黏膜損傷是胃熱證的主要病理變化。故本課題組采用基于嗜食辛辣厚味的飲食不節(jié)方法復(fù)制胃熱證大鼠模型,研究艾灸胃經(jīng)穴對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜的修復(fù)作用,探討“熱證可灸”的作用機(jī)制及其科學(xué)性。
清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只,體質(zhì)量(150±20)g,購(gòu)自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(浙)170803004],在廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF)分組飼養(yǎng),控制室溫22℃,相對(duì)濕度60%,自然光暗周期。
1.2.1 藥物及試劑來(lái)源 艾條選用清艾條(江蘇康美制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020253);無(wú)水乙醇(廣州威佳科技有限公司,純度為分析純,批號(hào):20170902-2);辣椒素(北京百靈威科技有限公司,批號(hào):LCCOQ91;純度:98%)。
1.2.2 藥品及試劑制備 ①乙醇溶液的制備:第1周量取30 mL無(wú)水乙醇加入270 mL純水,從而制備10%的乙醇水溶液,之后每周濃度提高10%,直至第4周乙醇濃度達(dá)到40%,第5周仍保持乙醇濃度為40%;②辣椒素和乙醇溶液制備:第1次稱(chēng)取0.15 g辣椒素,由于辣椒素不溶于水,需先將辣椒素溶解150 mL無(wú)水乙醇中,然后加入350 mL純水,此時(shí)辣椒素質(zhì)量濃度為0.2 g/L,之后每日辣椒素質(zhì)量濃度提高0.05 g/L,直至質(zhì)量濃度達(dá)到 0.9 g/L;③灌胃冰水制備: 常規(guī)冰水混合物溫度為0℃,可將冰塊與水按質(zhì)量比約為2∶1進(jìn)行混合,放置20 min后可基本達(dá)到該溫度;④泡浴涼水制備: 本研究所取涼水溫度為10℃,且用水量較大,需在盛裝8 L水后,放入冰塊若干,使水溫維持于10℃。
70只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為7組,每組10只,分別為:正常組、胃熱證組、胃熱艾灸組、胃熱艾灸對(duì)照組、胃寒證組、胃寒艾灸組、胃寒艾灸對(duì)照組。
2.2.1 胃熱證造模 參照楊萬(wàn)斌等[2]報(bào)道的胃熱證大鼠模型復(fù)制方法,造模周期為5周,前3周用乙醇溶液每日灌胃2次(10 mL/kg),后2周給予辣椒素和乙醇溶液每日灌胃2 次(10 mL/kg),并于灌胃后以該溶液1 mL注入大鼠口腔中給予味覺(jué)刺激。
2.2.2 胃寒證造模 參照楊萬(wàn)斌等[3]報(bào)道的胃寒證大鼠模型復(fù)制方法,給予冰水灌胃每日3次,并予以10℃涼水泡浴每日1次,15 min/次,泡浴后取出動(dòng)物,吹風(fēng)機(jī)吹干,標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),持續(xù)5周。
正常組、胃熱證組、胃寒證組:標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),正常組不造模,胃熱證組、胃寒證組分別復(fù)制胃熱證、胃寒證大鼠模型,模型復(fù)制方法同上,不艾灸,采用鼠板固定30 min/次,1次/天,連續(xù)干預(yù)12天。
胃熱艾灸組、胃寒艾灸組:標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),各組在造模結(jié)束后第2天即鼠板固定,艾灸胃經(jīng)梁門(mén)、足三里穴,30 min/次,1次/天,連續(xù)干預(yù)12天。
胃熱艾灸對(duì)照組、胃寒艾灸對(duì)照組:標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),各組在造模結(jié)束后第2日即鼠板固定,艾灸與胃經(jīng)梁門(mén)、足三里穴同水平,位于足陽(yáng)明胃經(jīng)與足少陽(yáng)膽經(jīng)之間的非經(jīng)非穴點(diǎn),30 min/次,1次/天,連續(xù)干預(yù)12天。
2.4.1 取穴方法 取穴方法參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]:梁門(mén):腹正中線(xiàn)與鎖骨中線(xiàn)之間的中線(xiàn)上,臍(根據(jù)類(lèi)比原理,在大鼠胸腹正中線(xiàn),胸骨柄上緣至外生殖器連線(xiàn)的上3/4與下1/4交界處)上4寸;足三里:膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約5 mm處。非經(jīng)非穴點(diǎn)即為與胃經(jīng)梁門(mén)、足三里穴同水平,位于足陽(yáng)明胃經(jīng)與足少陽(yáng)膽經(jīng)之間的非經(jīng)非穴點(diǎn)。
2.4.2 操作方法 大鼠成功造模后采用溫和灸,取穴定位后剪毛, 將隔熱貼剪3 mm孔, 貼于穴位上, 將車(chē)載軟臂手機(jī)支架固定實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,將艾條固定在支架尾端的夾子上,兩側(cè)各距同側(cè)穴位約5 mm,局部艾灸溫度控制在42℃左右。每次艾灸30 min,1次/天,連續(xù)干預(yù)12天,各組每日處理后松綁, 回籠正常飼養(yǎng)。
各組大鼠在治療結(jié)束后,所有動(dòng)物禁食不禁水,24 h后2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后斷頭取腦,并分離大腦皮質(zhì)和取出全胃,沿胃大彎剪開(kāi)胃壁,并用冰生理鹽水沖去胃黏膜表面的食物殘?jiān)?,并將全胃展開(kāi)平鋪于冰盤(pán)上,行胃黏膜損傷指數(shù)評(píng)分,用手術(shù)刀片刮取病變部位周?chē)父]部黏膜組織。將分離所得的大腦皮質(zhì)和胃竇部黏膜組織分別置于凍存管后在液氮中凍存30 s,并保存于-80℃冰箱中。
2.6.1 一般行為學(xué)觀察 ①精神及活動(dòng)狀態(tài):精神狀態(tài)良好,活潑好動(dòng),或者躁動(dòng)、興奮,或者踡縮,懶動(dòng);②毛發(fā)情況:觀察大鼠的毛發(fā)光澤、濃密程度以及皮膚彈性等;③大便性狀:觀察大鼠大便的性狀(軟爛、軟、適中、硬)、顏色(黃、黃褐、黑褐);④大鼠外觀:舌唇顏色(青紫、蒼白、淡紅、紅、紅紫)、耳廓(紅、蒼白、粉紅)。
2.6.2 胃黏膜大體形態(tài)損傷及評(píng)分觀察 各組大鼠完成一般情況觀察后斷頭處死,取胃,摘出全胃,沿大彎側(cè)剪開(kāi),充分暴露胃黏膜,采用Guth法[5]計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù),全胃各病灶的長(zhǎng)度按下面標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分后的和為損傷指數(shù),損傷寬度<1 mm(包括糜爛、出血點(diǎn))為1分,1 mm<損傷寬度<2 mm為2分,依次類(lèi)推,損傷寬度>2 mm者,指數(shù)加倍。
2.6.3 胃黏膜組織病理學(xué)觀察 取胃竇部1 cm×0.5 cm大小的組織塊,采用生理鹽水沖洗干凈,將標(biāo)本放入 10%的甲醛溶液中固定24~48 h,并進(jìn)行梯度乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋,二甲苯透明,切片。HE染色后光鏡下觀察胃黏膜組織病理學(xué)改變[6]。使用MoticTek3.1圖像采集系統(tǒng)行電腦圖像攝像。
2.6.4 胃黏膜組織中相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的表達(dá)量觀察 Western Blotting檢測(cè)21例組織樣本中NT、survivin的相對(duì)表達(dá)量。每例組織樣本各個(gè)靶標(biāo)蛋白檢測(cè)取約30 μg組織蛋白樣品,加入4×loading buffer,沸水浴10 min,10 000 rpm離心10 min;根據(jù)蛋白分子量制備12%或15%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離蛋白樣品;將SDS-PAGE膠上的蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將PVDF浸泡在含5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫孵育1 h;PBST洗膜,3×5 min;加入相應(yīng)的一抗, 4 ℃過(guò)夜;PBST洗3次,每次20 min;加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液,室溫孵育1 h;PBST洗3次,每次10 min;將PVDF膜與新鮮配制的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑(ECL)溶液反應(yīng)2 min,快速于暗室中曝光顯影。
正常組:一般狀態(tài)良好,活潑好動(dòng)、毛發(fā)光亮、濃密,皮膚彈性良好,飲食正常,大便成形,籠內(nèi)墊料可長(zhǎng)時(shí)間保持干爽清潔;胃熱證組:胃熱證模型大鼠表現(xiàn)為躁動(dòng)、興奮,大便呈顆粒狀,質(zhì)地干硬,舌唇耳廓色紅;胃熱艾灸組:大鼠躁動(dòng)、興奮,大便干硬較模型組有所好轉(zhuǎn),舌唇耳廓色紅,較胃熱證組變淡;胃熱艾灸對(duì)照組:大鼠的一般行為學(xué)與胃熱證組比較改變不明顯;胃寒證組:胃寒證模型大鼠表現(xiàn)為精神不振,踡縮,懶動(dòng),行動(dòng)遲緩,不喜爭(zhēng)斗, 體毛豎立且無(wú)光澤,大便稀溏,量多,舌唇色蒼白;胃寒艾灸組:大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),顯得較活潑好動(dòng),大便質(zhì)軟形成,舌唇色淡紅;胃寒艾灸對(duì)照組:大鼠精神狀態(tài)較前稍好轉(zhuǎn),但是大便性狀改變不明顯。
正常組大鼠胃黏膜皺襞完整,無(wú)破損,呈淡紅色,表面光滑色澤明亮,未見(jiàn)充血出血點(diǎn);胃熱證組大鼠皺襞破損,可見(jiàn)黏膜充血明顯,胃體表面有斑點(diǎn)狀潰瘍、糜爛點(diǎn),出血處顏色晦暗;胃熱艾灸組皺襞破損較胃熱證組有所恢復(fù),有少量出血點(diǎn),充血緩解;胃熱艾灸對(duì)照組與胃熱證組無(wú)明顯差異。
研究結(jié)果顯示,各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)性分布,但是經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)提示方差不齊,故采用 Tamhane T2 法進(jìn)行方差檢驗(yàn)和兩兩比較,與正常組相比較,胃熱證組和胃寒證組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高(P<0.05);與胃熱證組比較,胃熱艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05),胃熱艾灸對(duì)照組的胃黏膜損傷指數(shù)未見(jiàn)明顯改變(P>0.05);與胃寒證組比較,胃寒艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05),胃寒艾灸對(duì)照組的胃黏膜損傷指數(shù)未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)的比較分)
注:與正常組比較,aP<0.05;與胃熱證組比較,bP<0.05;與胃寒證組比較,dP<0.05;與胃熱艾灸組比較,cP<0.05;與胃寒艾灸組比較,eP<0.05。
正常組:可見(jiàn)胃黏膜層由黏膜下層、肌層及漿膜層組成,結(jié)構(gòu)清晰,層次分明;胃熱證組和胃寒證組可見(jiàn)黏膜壞死脫落,潰瘍形成,間質(zhì)出現(xiàn)水腫,細(xì)胞間隙增寬明顯,炎細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛;胃熱艾灸組和胃寒艾灸組可見(jiàn)胃黏膜淺層有細(xì)胞脫落,無(wú)明顯潰瘍形成;胃熱艾灸對(duì)照組和胃寒艾灸對(duì)照組胃黏膜組織病理學(xué)表達(dá)與胃熱證組和胃寒證組基本相同。見(jiàn)封三彩圖1。
在胃熱模型中,與正常組相比,胃熱證組中NT的表達(dá)有一定程度下調(diào)(P<0.05),艾灸處理后,與胃熱證組比,胃熱艾灸對(duì)照組表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),而胃熱艾灸組表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);survivin的表達(dá),與正常組相比,胃熱證組中survivin的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),艾灸處理后,胃熱艾灸組和胃熱艾灸對(duì)照組survivin的表達(dá)均有所升高(P<0.05),且胃熱艾灸組升高比胃熱艾灸對(duì)照組明顯。見(jiàn)圖2~3。
在胃寒模型中,與正常組相比,胃寒證組中NT和survivin的表達(dá)均有所下調(diào)(P<0.05),艾灸處理后,與胃寒證組比較,胃寒艾灸對(duì)照組NT和survivin的表達(dá)未見(jiàn)明顯上調(diào),而胃寒艾灸組NT和survivin的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4~5。
注:Z.正常組,R.胃熱證組,A.胃熱艾灸對(duì)照組,C.胃熱艾灸組。圖2 胃熱模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的表達(dá)情況比較
注:Z.正常組,R.胃熱證組,A.胃熱艾灸對(duì)照組,C.胃熱艾灸組;與Z比較,*P<0.05;與R比較,#P<0.05。圖3 胃熱模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比
注:Z.正常組,H.胃寒證組,B.胃寒艾灸對(duì)照組,D.胃寒艾灸組。圖4 胃寒模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的表達(dá)情況對(duì)比
注:Z.正常組,H.胃寒證組,B.胃寒艾灸對(duì)照組,D.胃寒艾灸組;與Z比較,*P<0.05;與H比較,#P<0.05。圖5 胃寒模型中胃黏膜組織中靶效應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比
“熱證可灸”是針灸學(xué)的經(jīng)典理論,是指使用艾灸來(lái)治療病性屬熱的證候。清代醫(yī)家吳師機(jī)在《理瀹駢文·續(xù)增略言》中記載:“若夫熱證亦可以用熱者,一則得熱則行也,一則以熱引熱使熱外出也,即從治之法也”。歷代醫(yī)家對(duì)“熱證施灸”不僅停留在理論的探討層面,還進(jìn)行臨證實(shí)踐,在運(yùn)用灸法治療臟腑實(shí)熱證方面記載頗豐,如熱在臟施灸者,《千金要方》云:“治五藏?zé)峒吧眢w熱,脈弦急者,灸節(jié)十四椎與臍相當(dāng)五十壯”,又云:“治心實(shí)熱,不能食,胸中滿(mǎn)隔上逆氣悶熱,灸心俞二七壯”;熱在腑施灸,《針灸大成》曰:“赤痢,灸小腸俞”?!锻馀_(tái)秘要》也曾引《古今驗(yàn)錄》云:“治熱結(jié)小便不通利方……取鹽填滿(mǎn)臍中,作大艾炷,令熱為度良”。《千金翼方》更是明確指出:“胃中熱,灸三里三十壯”。由此可見(jiàn),艾灸用于熱證的治療不僅有深厚的中醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ),而且具有豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。
本課題組在早期的研究也發(fā)現(xiàn)艾灸胃經(jīng)穴可特異性地降低胃黏膜損傷大鼠的胃黏膜損傷指數(shù),增加胃黏膜血流量,增強(qiáng)胃黏膜相關(guān)信號(hào)蛋白質(zhì)的表達(dá),從而防治胃黏膜損傷相關(guān)疾病,如胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎等[7-11]。國(guó)內(nèi)學(xué)者陳果等[12]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里可以明顯改善胃黏膜損傷大鼠的胃黏膜組織形態(tài), 降低胃黏膜損傷指數(shù),該作用可能與調(diào)節(jié)血清與組織中EGF、PGE2含量以及胃黏膜組織Bcl-2/Bax比例有關(guān),但該作用受腓總神經(jīng)通路破壞而干擾。陳慧娟等[13]研究發(fā)現(xiàn),艾灸胃經(jīng)穴可以明顯上調(diào)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜的損傷指數(shù),該作用可能與上調(diào)胃黏膜細(xì)胞的Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-2及IAPs 410等10種蛋白質(zhì)磷酸化水平,下調(diào)TNF、Fas、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9及Bax 6等18種蛋白質(zhì)磷酸化水平有關(guān),且該作用存在臟腑經(jīng)脈的特異性。粟艷梅等[14]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里等穴位可以促進(jìn)脾虛型胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷的修復(fù),該作用可能與通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性保護(hù)蛋白MT的含量及HSP 70的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。劉密等[15]研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里等穴位預(yù)處理可以減輕應(yīng)激性潰瘍大鼠的胃黏膜損傷指數(shù),該作用可能與上調(diào)血清保護(hù)因子(PGE2、CGRP、MT和HSP 70)而達(dá)到其保護(hù)胃黏膜的作用有關(guān)。大量的研究證實(shí),艾灸作用于穴位可以調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能,實(shí)施對(duì)胃黏膜損傷的修復(fù)作用。然而,艾灸是否對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷同樣具有修復(fù)作用,則未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為了從實(shí)驗(yàn)的層面證實(shí)“熱證可灸”的可行性和科學(xué)性,本課題組以胃熱證大鼠為切入,觀察艾灸胃經(jīng)穴對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷的修復(fù)作用,具體研究結(jié)果如下。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,胃熱證模型組大鼠躁動(dòng)、興奮,胃寒證模型組精神不振、踡縮、懶動(dòng)等,胃熱證模型組和胃寒證模型組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高(P<0.05),胃黏膜組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)黏膜壞死脫落,潰瘍形成,間質(zhì)出現(xiàn)水腫,細(xì)胞間隙增寬明顯,炎細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛;與模型組比較,胃熱艾灸組可以改善大鼠躁動(dòng)、奮興等胃熱證的證候,胃寒艾灸組可以改善大鼠精神不振、踡縮、懶動(dòng)等胃寒證的證候,胃熱艾灸組和胃寒艾灸組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯下降(P<0.05),胃熱艾灸組和胃寒艾灸組的胃黏膜組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)胃黏膜淺層有細(xì)胞脫落,無(wú)明顯潰瘍形成;胃熱艾灸對(duì)照組和胃寒艾灸對(duì)照組無(wú)論在一般行為學(xué)的證候方面,還是在胃黏膜損傷指數(shù)和組織病理學(xué)方面均未見(jiàn)明顯變化。
NT[16]對(duì)胃黏膜的完整性發(fā)揮重要的作用,既保護(hù)胃黏膜又參與潰瘍的形成[17]。NT可抑制胃酸、胃蛋白酶分泌,刺激胃黏膜PG和NO釋放,增強(qiáng)胃黏膜對(duì)損傷的抵抗力[18]。Survivin又名生存素,屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptos is protein,IA)[19],可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)血管生成等生物活性[20]。多數(shù)研究顯示主要在腫瘤組織中發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用,在正常器官組織中無(wú)表達(dá),但譚愛(ài)國(guó)等[21]提出在正常胃黏膜組織中亦有表達(dá)。陳敏敏[22]的研究與譚愛(ài)國(guó)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同,并且發(fā)現(xiàn)人體正常胃黏膜組織中含量隨年齡明顯降低,結(jié)合Survivin廣譜的抗調(diào)亡細(xì)胞作用,提示正常胃黏膜組織中的抗細(xì)胞調(diào)亡的作用隨齡降低。本研究表明,胃熱證組和胃寒證組大鼠的胃黏膜細(xì)胞中NT和Survivin的表達(dá)下降,說(shuō)明胃熱證、胃寒證大鼠的胃黏膜損傷可能與上述兩種靶效應(yīng)蛋白下調(diào),導(dǎo)致其對(duì)損傷的抵抗力和抑制細(xì)胞凋亡作用下降有關(guān),艾灸胃經(jīng)穴可以上調(diào)胃黏膜細(xì)胞中NT和Survivin的水平,而艾灸對(duì)照組則未見(jiàn)明顯變化,說(shuō)明NT和Survivin可能是艾灸調(diào)控胃熱證和胃寒證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的靶效應(yīng)蛋白,且穴位具有特異性。
本研究在一定程度上證明了艾灸胃經(jīng)穴可以促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜的損傷修復(fù),該作用與胃寒證大鼠作用相當(dāng),說(shuō)明“熱證可灸”具有科學(xué)性,本研究為臨床艾灸干預(yù)胃熱證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并在一定程度上闡述了其產(chǎn)生作用的可能效應(yīng)蛋白,對(duì)于揭示胃黏膜損傷疾病的艾灸治療作用具有創(chuàng)新意義。