謝 璐，徐志遠，張 魯，呂文發(fā)，劉國世*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193）

四倍體胚胎在正常發(fā)育過程中只發(fā)育為胚外組織（如滋養(yǎng)層、卵黃囊膜、尿囊膜、胎盤等）[1]，而胚胎干細胞（ES 細胞）是具有自我更新和多向分化潛能的胚胎細胞，具有向機體各種組織細胞分化的能力。如果將二者聚合形成嵌合體，其發(fā)育能力互相補償，可得到幾乎完全由ES 細胞發(fā)育而來的個體，這種技術被稱為四倍體補償技術，又被稱為兩步克隆法[2]。目前，四倍體補償技術在ES 細胞全能型的鑒定、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物上應用十分廣泛，使用基因修飾的ES 細胞產(chǎn)生具有生殖系傳遞能力的嵌合體是新小鼠模型建立的重要方式[3-5]；且四倍體補償技術相比于體細胞核抑制而言，操作簡便、效率高、獲得轉(zhuǎn)基因動物時間短，在ES 細胞上進行基因編輯也較容易[6-7]。嵌合體為研究細胞譜系和分析突變小鼠的復雜表型及研究胚胎發(fā)育機理提供了強有力的工具[8]，因而四倍體胚胎的制備及儲存顯得尤為重要。本研究利用開放式拉長細管（OPS）玻璃化冷凍法對四倍體胚胎進行冷凍，解凍后進行培養(yǎng)，通過觀察囊胚率等對四倍體胚胎發(fā)育情況和發(fā)育所用時間進行評估，以期在四倍體補償技術中嵌合體制備時提高四倍體胚胎的利用率，便于四倍體胚胎的儲存和運輸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡CD-1 母鼠50 只（中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心）于鼠房適應性飼養(yǎng)1 周，自由采食（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心生產(chǎn)全價營養(yǎng)顆粒飼料）和飲水。光控周期為08:00—20:00，室內(nèi)溫度為20～22℃。

1.1.2 實驗試劑 體外操作液M2 液；體外培養(yǎng)液M16液；電融合液：0.3 mol/L 甘露醇溶液；預處理液：10%乙二醇液；解凍液：0.5 mol/L 蔗糖溶液；玻璃化冷凍液：先向7 mL 的mPBS 中添加0.3 g/mL 聚蔗糖和0.5 mol/L 蔗糖，而后加入1.5 mL 乙二醇，搖勻，邊輕搖邊滴入1.5 mL 的二甲基亞砜（DMSO），存于4℃?zhèn)溆?。試劑若無特殊說明，均購自Sigma aldrich 公司。

1.1.3 實驗儀器 電融合儀，CO2培養(yǎng)箱，體式顯微鏡，超凈工作臺，熒光正置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細胞胚胎收集 對20～25 g 的雌性CD-1 小鼠于19:00 注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）10 IU，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）10 IU，繼而與雄鼠以1∶1 比例合籠。第2 天08:00 檢查陰道栓，見栓后第2 天19:00 頸部脫臼法處死受孕雌鼠，沖洗輸卵管并收集2-細胞胚。在體式顯微鏡下挑選正常2-細胞置于M2 液中。

1.2.2 電融合法制作四倍體胚胎 將電融合液加入電融合槽內(nèi)，將2-細胞胚用電融合液洗滌3 次后移入電融合槽的兩電極間。用細玻璃針尖端調(diào)整胚體接觸面與電場方向垂直。3 V 交流電排序，調(diào)節(jié)直流脈沖電壓至50 V。按下脈沖觸發(fā)開關2 次，2 次間隔時間為35 μs，處理后用M2 液洗滌胚體2 次，移入M16 液中培養(yǎng)，30～60 min后觀察，棄去未融合胚胎，已融合胚胎繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 制作OPS 選用0.25 mL 的塑料細管，在酒精燈燒熱后迅速拉伸制成OPS 細管，管壁厚度在0.01～0.02 mm、管壁內(nèi)徑為0.10～0.20 mm、管壁外徑18～22 mm，用刀片斷開，最終使OPS 細管的長度保持在22～26 mm。

1.2.4 四倍體胚胎的玻璃化冷凍 冷凍前2 h 將室溫調(diào)至（25±0.5）℃，將所用溶液在37℃預熱。冷凍時將四倍體胚胎移入預處理液中平衡30 s，再轉(zhuǎn)入冷凍液中處理25 s。繼而立刻將四倍體胚胎及少量冷凍液吸入OPS 中，標記投入液氮并保存。

1.2.5 四倍體胚胎細胞的解凍 從液氮中取出裝有冷凍四倍體胚胎的OPS 管，迅速浸入放置在37℃恒溫臺體視鏡下的解凍液中，解凍后立即將四倍體胚胎移入新配制的解凍液中平衡5 min。繼而于磷酸緩沖液（PBS 液）中洗滌1 遍，然后將四倍體胚胎移入M16 培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱內(nèi)恢復1 h，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 解凍后四倍體胚胎的觀察 設置3 個實驗組：二倍體胚胎對照組（2N 對照組），即二細胞（2-C）胚胎不進行電激；四倍體胚胎未冷凍組（4N 新鮮組），即2-C 電激1 次后發(fā)生融合，四倍體胚胎發(fā)育到早期囊胚不進行冷凍；四倍體胚胎冷凍組（4N 冷凍組），即2-C電激1 次后發(fā)生融合，四倍體胚胎發(fā)育到早期囊胚進行冷凍。分別觀察各組的囊胚數(shù)、完全孵化囊胚數(shù)，統(tǒng)計囊胚率和孵化囊胚率。分別觀察4N 新鮮組和4N 冷凍組在解凍的四倍體胚胎繼續(xù)向囊胚發(fā)育的過程，從各組第1 枚早期囊胚出現(xiàn)開始，每隔半小時記錄各組發(fā)育至囊胚腔直徑達到三分之二、可滿足后期注射要求的囊胚個數(shù)，統(tǒng)計各組完全發(fā)育為囊胚腔直徑達到三分之二的囊胚所用時間。

1.2.7 囊胚細胞數(shù)染色計數(shù) 細胞核熒光標記計囊胚細胞數(shù)，將囊胚在含4%多聚甲醛的DPBS 中固定10 min。而后把固定好的囊胚轉(zhuǎn)移到Hochest 染液中避光染色10 min，再用含0.1% PVA 的PBS 洗3 遍，將囊胚放到載玻片上，臨時封片，蓋上蓋玻片后在熒光正置顯微鏡下觀察細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采用單因素方差分析，均值的多重比較采用Duncan′s 進行，結(jié)果用平均值±標準誤表示，P＜0.05時為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 OPS 玻璃化冷凍解凍后四倍體胚胎的發(fā)育能力 由表1 可見，電融合后4N 新鮮組的囊胚率、孵化囊胚率均與2N 對照組差異不顯著；4N 冷凍組囊胚率與4N 新鮮組差異不顯著，但4N 冷凍組孵化囊胚率較高，顯著高于4N 新鮮組。

2.2 冷凍對四倍體胚胎囊胚細胞數(shù)的影響 如圖1 和表2 所示，與2N 新鮮組相比，4N 新鮮組的囊胚細胞數(shù)約減半（P＜0.05）。4N 冷凍組的囊胚細胞數(shù)與4N 新鮮組無顯著差異。

2.3 冷凍后四倍體胚胎發(fā)育至滿足注射要求所需時間如圖2 所示，與4N 新鮮組相比，4N 冷凍組胚胎都發(fā)育到適合用于注射囊胚的所需時間較少（P＜0.05），其發(fā)育速度相對更快更為集中。

表1 解凍后四倍體胚胎冷凍組和二倍體、四倍體新鮮組的發(fā)育情況

圖1 各組囊胚細胞染色代表圖（標尺：100 μm）

表2 解凍后四倍體囊胚和各未冷凍組囊胚的囊胚細胞數(shù)

圖2 各組全部發(fā)育至囊胚腔直徑達到三分之二的囊胚所用時間

3 討 論

四倍體胚胎的常用制作方法有3 種：一是物理注射法；二是利用化學試劑抑制卵裂球分裂法，一般使用的化學試劑是細胞松弛素 B（Cytochalasin，CB）和秋水仙素等[9]；三是卵裂球融合法，仙臺病毒、化學試劑和電刺激都可使細胞發(fā)生融合[10]。電刺激融合法制備四倍體細胞相較其他方法而言，無毒副作用，操作更為簡捷，融合效率更高。因而，本實驗選擇采用電融合法制備四倍體細胞，共有231 枚二細胞參與電融合，融合222 枚，電融合效率為96.1%。融合后的四倍體胚胎后期發(fā)育囊胚率和孵化囊胚率與二倍體胚胎相比無明顯差異，電融合法制備四倍體胚胎對胚胎前期的發(fā)育無顯著影響。觀察其發(fā)育過程，新鮮四倍體胚胎的囊胚細胞數(shù)為新鮮二倍體胚胎的一半左右；冷凍后四倍體胚胎的囊胚細胞數(shù)與新鮮四倍體差異不顯著，4N 冷凍組和新鮮組僅是囊胚細胞數(shù)減半，形態(tài)上與二倍體并無區(qū)別。

OPS 玻璃化冷凍是目前最常用的一種便捷快速的降溫方式，已廣泛應用于小鼠等哺乳動物的卵母細胞及早期胚胎的冷凍[11-12]，但對小鼠四倍體胚胎的冷凍卻鮮有報道。本實驗用OPS 玻璃化冷凍法對小鼠四倍體胚胎進行冷凍操作，實驗結(jié)果顯示冷凍對囊胚率和囊胚細胞數(shù)均無顯著影響，可顯著提高四倍體胚胎的孵化囊胚率，說明OPS 玻璃化冷凍并不會降低四倍體胚胎的發(fā)育潛能。四倍體胚胎制作成功之后可進行冷凍儲存，實驗中可根據(jù)受體鼠數(shù)量解凍相應數(shù)量的四倍體胚胎，在一定程度上避免浪費，同時節(jié)省人力物力。嵌合體胚胎在制作過程中非常繁瑣，用囊胚注射法制作嵌合體胚胎時需要挑選囊胚，只有當囊胚腔直徑達到三分之二后的一段時間內(nèi)才適合注射。操作過程中會有大部分囊胚由于發(fā)育階段不符合要求被放棄，原因是胚胎的發(fā)育速度快慢不一，跨度較久。

觀察四倍體胚胎解凍之后培養(yǎng)，這些胚胎均在2～3 h內(nèi)發(fā)育成囊胚腔直徑達到三分之二的階段，與對照組相比發(fā)育速度較快、發(fā)育階段比較集中。溫度和機械刺激、能量狀態(tài)、激素、生長因子、pH 以及抗氧化物等外在因素均能影響胚胎發(fā)育速率[13]，冷凍過程會影響胚胎生化活動和新陳代謝速率，冷凍解凍后依然能保持胚胎染色質(zhì)完整性[14]，可能使胚胎發(fā)育中各胚層的發(fā)育速率略有調(diào)整，最終使得發(fā)育速率更為集中。因此，大部分囊胚都能用于注射，減少了四倍體胚胎的浪費，在大量積累了冷凍的四倍體早期囊胚后，可進行連續(xù)移植，提高嵌合體胚胎制作時注射和移植的效率。

4 結(jié) 論

本實驗通過電融合法制得四倍體胚胎，利用OPS玻璃化冷凍法對四倍體胚胎進行冷凍。解凍后對其發(fā)育情況進行觀察發(fā)現(xiàn)，OPS 玻璃化冷凍可顯著提高四倍體胚胎的孵化囊胚率，且發(fā)育速度更快。冷凍可作為四倍體胚胎儲存、運輸?shù)挠行侄危岣咔逗象w胚胎制作的效率。