薛 娣

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 南陽 473000)

糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常見的一種并發(fā)癥，常引起腎功能衰竭，是患者致死的主要原因。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病以陰虛為本、燥熱為標(biāo)，治療多采用滋陰清熱、生津、滋腎等方法[1-3]。近年來，針刺、艾灸等方法治療糖尿病取得了較好的療效[4-7]。研究報(bào)道，針?biāo)幗Y(jié)合在糖尿病的治療及其并發(fā)癥的防治方面具有較好的效果[6-8]。本研究采用針刺加補(bǔ)氣化瘀中藥的聯(lián)合方法治療糖尿病腎病大鼠，通過觀察大鼠空腹血糖(fastingblood-glucose,FBG)、血肌酐(serumcreatinine，SCr)、尿肌酐(urinecreatinine，UCr)、內(nèi)生肌酐清除率(creatinineclearance,Ccr)、一氧化氮(nitricoxide，NO)、一氮化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1) 等指標(biāo)，研究其對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雄性SD大鼠，50只，清潔級(jí)，3月齡，體質(zhì)量150～200g，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK豫2010-0002。將大鼠喂養(yǎng)在室溫20～25 ℃的清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，普通飼料喂飼，自由飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

補(bǔ)氣化瘀藥物處方組成：黃芪12g，赤芍25g，當(dāng)歸20g，紅花15g，川芎15g，地龍20g，桃仁15g。藥材購(gòu)自河南省醫(yī)藥藥材有限公司，水煎制劑濃縮至每毫升藥液含生藥1g，高壓滅菌后存放于4 ℃冰箱內(nèi)備用。鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)20120907；TGF-β1多克隆抗體，北京博奧森生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20150219；血糖測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程公司產(chǎn)品，批號(hào)20141209。血糖測(cè)試儀，南京建成生物工程公司產(chǎn)品；G6805-2A型低頻電針儀，上海華誼醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品；PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與模型的建立

喂養(yǎng)大鼠1周后, 將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組、藥物組和針?biāo)幝?lián)合組5組，每組10只[4]。禁食、不禁水12h后，除正常對(duì)照組外，其余4組均一次性腹腔注射STZ60μg/g建立糖尿病模型；正常對(duì)照組注射等體積檸檬酸緩沖液。48h后采用葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖，血糖≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功。

1.4 給藥方法

造模成功后第7天，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予生理鹽水0.015mL/g灌胃，1d1 次；藥物組給予補(bǔ)氣化瘀藥物0.015mL/g灌胃，1d1 次；電針組給予電針治療[5](強(qiáng)度1mA，頻率160～180次/min)，取穴足三里、內(nèi)庭，每次30min，1d1 次；針?biāo)幝?lián)合組采用電針和補(bǔ)氣化瘀藥物相結(jié)合的聯(lián)合療法。各組均連續(xù)治療6周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般情況

藥物干預(yù)結(jié)束后觀察大鼠的一般情況，包括體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)、飲食等。

1.5.2FBG、NO、UCr、SCr和Ccr

FBG測(cè)定：治療停止前1d尾靜脈采血，采用血糖測(cè)試儀測(cè)量FBG。

NO、UCr測(cè)定：治療停止前1d收集24h尿液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)NO、UCr。

SCr測(cè)定：治療停止24h后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50g/L的水合氯醛10μL/g腹腔注射麻醉, 心臟取血, 分離血清， -20 ℃保存?zhèn)溆?。采用生化分析儀檢測(cè)SCr。

Ccr測(cè)定：根據(jù)生化檢測(cè)數(shù)值計(jì)算Ccr數(shù)值。Ccr=尿肌酐濃度(mg/L)×尿量(L/24h)/血漿肌酐濃度(mg/L)

1.5.3 腎臟肥大指數(shù)

心臟取血后處死大鼠，取雙側(cè)腎臟，清洗干凈，用濾紙吸干腎表面血液，稱量質(zhì)量并計(jì)算腎臟肥大指數(shù)，甲醛固定，備用[7]。腎臟肥大指數(shù)=雙側(cè)腎質(zhì)量總和(g) /體質(zhì)量(kg) × 100%

1.5.4 腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達(dá)

取甲醛固定24h的腎組織，流水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)為70，80，90，95，100mL/L的乙醇梯度依次脫水各30min，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度約為2μm)，蘇木蘇-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)、過碘酸-希夫(periodicacidschiff，PAS) 染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。免疫組織化學(xué)法測(cè)定TGF-β1表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，行動(dòng)敏捷。模型對(duì)照組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯、發(fā)黃，行動(dòng)遲緩，多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕的“三多一少”癥狀明顯。藥物組、電針組及針?biāo)幝?lián)合組大鼠的一般狀態(tài)均較模型對(duì)照組有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠FBG、SCr、UCr和Ccr對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠FBG、SCr、和Ccr均升高,UCr降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、和Ccr均降低,UCr升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與藥物組和電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、Ccr均下降，UCr升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1 。

組 別nFBG/(mmol·L-1 )SCr/(μmol·L-1 )UCr/(mmol·L-1 )Ccr/(mL·min-1 )正常對(duì)照組106.7±0.7148.1±3.2329.12±5.20.5±0.095模型對(duì)照組1023.5±2.23?58.7±4.15?7.42±4.11?1.32±0.246?藥物組1018.4±3.59#54.8±4.13#13.13±5.45#0.83±0.225#電針組1019.1±3.61#54.6±4.13#11.83±4.66#0.91±0.21#針?biāo)幝?lián)合組107.8±2.94#△▲50.7±4.04#△▲23.41±1.32#△▲0.62±0.167#△▲

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05；與藥物組對(duì)比，△P<0.05；與電針組對(duì)比，▲P<0.05

2.3 各組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NOS、NO和NO/ET對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組腎臟肥大指數(shù)、NOS水平和NO活性升高，NO/ET降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NO水平和NOS活性均顯著降低，NO/ET明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。與藥物組及電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組腎臟肥大指數(shù)、NOS水平和NO活性均降低 ，NO/ET升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組 別n腎臟肥大指數(shù)/10-3NOS /( ng·L-1 )NO/(μmol·L-1 )NO/ET /( ng·L-1 )正常對(duì)照組104.11±0.320.15±0.031.12±0.090.19±0.03模型對(duì)照組107.66±0.56?0.34±0.02?1.84±0.18?0.08±0.03?藥物組105.14±0.36#0.24±0.05#1.42±0.21#0.11±0.03#電針組105.94±0.31#0.27±0.03#1.49±0.19#0.13±0.03#針?biāo)幝?lián)合組104.61±0.52#△▲0.19±0.04#△▲1.19±0.23#△▲0.21±0.04#△▲

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，* P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，# P<0.05；與藥物組對(duì)比，△P<0.05；與電針組對(duì)比，▲P<0.05

2.4 各組大鼠腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達(dá)對(duì)比

光鏡下：正常對(duì)照組大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻，無增厚，未見腎小球肥大。模型對(duì)照組大鼠腎臟腎小球腫脹增大，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，腎小管腫脹明顯[9]。藥物組和電針組大鼠腎臟有不同程度的病理改變，但較模型對(duì)照組輕，表現(xiàn)為腎小球輕度肥大，少量的系膜細(xì)胞和基質(zhì)的增多，腎小管腫脹不明顯。與藥物組、電針組對(duì)比,針?biāo)幝?lián)合組腎小球體積明顯減小，病理改變減輕。

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠TGF-β1表達(dá)明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠TGF-β1表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與藥物組及電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組大鼠TGF-β1表達(dá)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3各組大鼠腎小球TGF-β1表達(dá)對(duì)比

組 別n吸光度值正常對(duì)照組100.39±0.12模型對(duì)照組100.81±0.02?藥物組100.45±0.03?#電針組100.47±0.03#針?biāo)幝?lián)合組100.40±0.02#△▲

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，* P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，# P<0.05；與藥物組對(duì)比，△P<0.05；與電針組對(duì)比，▲P<0.05

3 討 論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”并發(fā)“水腫”范疇，是一種以腎小球肥大、腎小球?yàn)V過減少、腎纖維化和腎功能損害為特征的慢性病。根據(jù)治病求本、兼治其標(biāo)的中醫(yī)治療原則，中醫(yī)藥在臨床癥狀改善率、降低SCr、改善腎功能等方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)針法治療糖尿病也取得了較好的療效[4-7]。本研究采用針?biāo)幝?lián)合治療，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病腎病大鼠有減輕腎臟損傷的保護(hù)作用。

NO為內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子，可降低血管張力，造成腎細(xì)胞損害，促進(jìn)炎癥產(chǎn)生與發(fā)展[9]。NOS為一氧化氮合成酶，可促進(jìn)NO的合成。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎臟表達(dá)高水平內(nèi)皮型NOS，激活NO活性，引起腎小球高濾過狀態(tài)及系膜基質(zhì)的增生[10]。因此NO作為血管活性物質(zhì)參與了腎小球高灌注、高濾過的發(fā)生、發(fā)展和腎細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量下降，腎臟肥大指數(shù)、FBG、Ccr、SCr均顯著升高，UCr數(shù)值降低，提示糖尿病大鼠腎臟功能受損。同時(shí)模型對(duì)照組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NO水平和NOS活性升高較明顯，NO/ET顯著降低，表明此模型可能處于DN早期。針?biāo)幝?lián)合治療后，大鼠腎臟肥大指數(shù)顯著降低，NO水平、NOS活性也降低，NO/ET卻明顯升高，證實(shí)針?biāo)幝?lián)合治療通過影響大鼠體內(nèi)NO水平、NOS活性和NO/ET，使腎小球的高濾過降低，對(duì)早期DN腎臟起到保護(hù)作用。TGF-β是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化功能的活性多肽，機(jī)體內(nèi)以TGF-β1含量最高。在腎臟中，TGF-β廣泛分布于腎小管、腎小球與腎間質(zhì)中，TGF-β在DN的發(fā)生與發(fā)展中扮演著非常重要的角色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在DN發(fā)生早期，TGF-β1及TGF-β1mRNA表達(dá)就明顯升高，血糖水平隨著TGF-β1水平升高而升高[3]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示TGF-β1具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。RNA測(cè)序技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TGF-β1介導(dǎo)了腎纖維化和DN的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠不僅血糖升高，而且Ccr升高、TGF-β1表達(dá)增多。提示糖尿病腎病的病理過程可能與這些因素的參與有關(guān)。針?biāo)幝?lián)合組大鼠在6周的干預(yù)治療后，F(xiàn)BG、SCr、Ccr均明顯低于模型對(duì)照組，特別是TGF-β1表達(dá)顯著降低，說明了針?biāo)幝?lián)合治療能夠降低腎臟TGF-β1表達(dá)而使血糖水平降低，從而改善DN大鼠的腎臟功能。

綜上所述，中醫(yī)針?biāo)幝?lián)合療法可有效改善DN大鼠的腎功能并降低血糖水平，有望在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用。