馬燕花，楊少軍，師 霞，白洲霞，邱曉青

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730101； 2.北海市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 北海 536000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及脂代謝紊亂、胰島素抵抗、肝脂質(zhì)過氧化增加、細(xì)胞因子異常等多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的病理生理環(huán)節(jié)，但均可納入Day和Tames于1998年提出的“二次打擊”學(xué)說[1]。第一次打擊以胰島素抵抗為主；第二次打擊以氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)為主，在NAFLD的疾病進(jìn)展中起到重要作用[2-3]。過度蓄積的游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致肝組織核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-κB, NF-κB)的活化和表達(dá)增強(qiáng)，最終引發(fā)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和脂性凋亡[4-5]。本研究通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，用慈姑消脂丸進(jìn)行干預(yù)，檢測肝組織NF-κB和NF-κB誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá)，探討慈姑消脂丸對NAFLD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK(甘)2015-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度50%～ 60%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食飲水，普通飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定，并通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號：2015-0361。

1.2 藥品、試劑與儀器

慈菇消脂丸處方組成：山慈菇、法半夏、茯苓、柴胡、丹參、土鱉蟲、薏苡仁、黃芩、澤瀉、枸杞、生山楂等14味中藥。中藥材由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供，委托甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室的王曉莉主任藥師鑒定為正品。制劑以水為溶媒提取(正交實(shí)驗(yàn))再濃縮，將不適合提取的藥物進(jìn)行粉碎，加入到濃縮液中，制成半濃縮型水丸，規(guī)格60 g/瓶，每丸質(zhì)量0.135 g，相當(dāng)于生藥材0.252 g。鹽酸吡格列酮片，規(guī)格15 mg，7片/盒，北京太洋藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批次號161101。高脂飼料(普通飼料+15%豬板油+2%膽固醇+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉)、普通飼料(總熱量15.335 J/g，其中碳水化合物熱卡占53%，脂肪熱卡占9%，蛋白質(zhì)熱卡占20%)，均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，真空包裝成10 kg/袋。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號13352801)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號14640501)、總膽固醇(TC)試劑盒(批號13585401)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號14854801)，均購自于德國羅氏(Roche)診斷公司；焦碳酸二乙酯 (diethyl pyrocarbonate，DEPC)， 購自Amresco公司，批號E174；Trizol(批號9109)、qPCR反應(yīng)試劑盒(批號RR420A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號RR047A)，均購自日本Takara公司；兔抗大鼠β-actin抗體(批號ab8227)、兔抗大鼠NF-κB抗體(批號ab32360)、兔抗大鼠iNOS抗體(批號ab15323)，均購自Abcam公司；大范圍蛋白定量試劑盒，購自Sigma公司，批號93736；蛋白Marker，購自Thermo公司，批號26634。Alcyon 300型全自動(dòng)生化分析儀，美國雅培公司產(chǎn)品；AlphaImager 2200型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha公司產(chǎn)品；Mx3005P型實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；PowerPac Universal型電泳儀、Mini Protean 3 Cell型電泳槽，伯樂小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽，均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；VANOXAHB-LB型OLYMPUS萬能顯微鏡，日本OLYWPUS公司產(chǎn)品；HITACHI-HS500透射電鏡，日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與分組

參照文獻(xiàn)[6]方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)制備NAFLD模型。取Wistar大鼠60只，以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量編號，以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組(10只)和造模組(50只)2組。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，至第12周末造模結(jié)束，通過肝臟的病理變化確定造模成功與否。模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)如下。肉眼觀察：造模組大鼠肝臟明顯腫大，呈黃色缺血狀。HE染色、鏡下觀察：造模組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，脂滴大小不等，部分融合為大脂滴，界限不清；肝索紊亂，少數(shù)可見點(diǎn)狀壞死，碎屑狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型對照組，慈菇消脂丸高、中、低劑量組，鹽酸吡格列酮片組，每組10只，開始灌胃給藥。慈菇消脂丸高、中、低劑量組依次灌胃慈菇消脂丸水煎劑6.48，3.24，1.62g/kg體質(zhì)量，鹽酸吡格列酮片組灌胃鹽酸吡格列酮片1.35g/g體質(zhì)量，正常對照組和模型對照組每日灌胃等容量的生理鹽水。灌胃體積為10 μL/g體質(zhì)量，1 d 1次。連續(xù)灌胃給藥6周。

1.4 檢測指標(biāo)

灌胃結(jié)束后，動(dòng)物禁食24 h，次日用質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 g/L的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，分離血清用于測定生化指標(biāo)；收集肝臟標(biāo)本，經(jīng)冷生理鹽水清洗后鋁箔包裹置于液氮內(nèi)速凍，保存于-80 ℃冰箱。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定iNOS mRNA表達(dá)，Western-Blot法測定NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)水平。

1.4.1 肝功能與血脂

使用全自動(dòng)生化分析儀測定血清ALT、AST、TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)活性。

1.4.2 iNOS mRNA表達(dá)

采用Real-time PCR。取約100 μg肝組織，用Trizol法提取總 RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測定樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/L)。檢測 A260/A280的比值在1.8～2.1，提示RNA質(zhì)量較好。取1 μg RNA樣品用于合成cDNA。按照Real-time PCR試劑盒說明對iNOS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，iNOS mRNA檢測所需引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則，由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s后，開始40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s)，溶解曲線制備60 ℃-95 ℃，0.5 ℃/s。靶基因相對表達(dá)量用 2-ΔΔct計(jì)算。

表1 iNOS基因Real-time PCR檢測引物序列

1.4.3 NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)

采用Western-Blot法檢測。取20 mg左右冷凍的肝臟組織樣本，剪碎，加入RIPA組織裂解液提取各組肝組織總蛋白，每個(gè)樣本取出20 μL蛋白液進(jìn)行蛋白定量，定量后每個(gè)泳道上樣20 μL于SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，取出PVDF膜，封閉結(jié)束后，將膜置于按1∶1 000稀釋的一抗溶液中，4 ℃搖床輕搖孵育12 h，然后轉(zhuǎn)入按1∶5 000稀釋的二抗溶液中，室溫?fù)u床孵育120 min。等比例混合ECL化學(xué)發(fā)光液，均勻滴加在清洗完畢的PVDF膜表面，以保鮮膜包覆封裝后放置于暗盒中，在暗室中顯影曝光。

1.4.4 肝組織形態(tài)學(xué)

取部分肝組織用40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)制備組織石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝功能和血脂對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，慈菇消脂丸高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平降低 (P<0.01)；慈菇消脂丸低劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG均明顯降低(P<0.01)，LDL-C活性無顯著變化(P﹥0.05)；鹽酸吡格列酮片組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C活性明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠肝功能和血脂對比

組 別劑量/(g·kg-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)正常對照組11.92±0.9760.50±10.331.36±0.230.62±0.380.29±0.15模型對照組98.63±64.15??130.63±54.99??1.87±0.32??1.44±0.75??0.67±0.15??鹽酸吡格列酮片組0.001 3547.13±10.21##74.20±25.13##1.47±0.36#0.86±0.38##0.43±0.23#慈菇消脂丸高劑量組6.4836.80±10.27##59.00±5.66##1.18±0.42##0.75±0.46##0.30±0.14##慈菇消脂丸中劑量組3.2445.43±18.30##71.67±29.79##1.39±0.51##0.65±0.31##0.12±0.24##慈菇消脂丸低劑量組1.6234.62±8.00##80.00±25.67##1.09±0.32##0.76±0.42##0.51±0.26

注：與正常對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比， # P<0.05， ## P<0.01

2.2 各組大鼠肝組織iNOS mRNA表達(dá)對比

模型對照組大鼠肝組織中iNOSmRNA的水平明顯高于正常對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，慈菇消脂丸低、中、高劑量組及鹽酸吡格列酮片組中iNOSmRNA的水平均顯著下降(P<0.01)。慈茹消脂丸各劑量組與鹽酸吡格列酮片組對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比 ，慈菇消脂丸高、中劑量組和鹽酸吡格列酮片組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；慈菇消脂丸低劑量組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，但iNOS蛋白表達(dá)無顯著變化(P﹥0.05)。慈菇消脂丸高劑量組在下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)方面作用優(yōu)于鹽酸吡格列酮片組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4、圖1。

組 別劑量/(g·kg-1)iNOS mRNA 正常對照組0.14±0.03模型對照組1.00±0.00??鹽酸吡格列酮片組0.001350.32±0.11##慈菇消脂丸高劑量組6.480.44±0.38##慈菇消脂丸中劑量組3.240.30±0.18##慈菇消脂丸低劑量組1.620.27±0.03##

注：與正常對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比，## P<0.01

組 別劑量/(g·kg-1)NF-κB/β-actin/蛋白相對表達(dá)量iNOS/β-actin/蛋白相對表達(dá)量正常對照組0.30±0.080.05±0.02模型對照組0.94±0.09??0.48±0.02??鹽酸吡格列酮片組0.001350.21±0.01##0.07±0.03##慈菇消脂丸高劑量組6.480.01±0.00##△△0.13±0.07##慈菇消脂丸中劑量組3.240.33±0.04##0.34±0.02##慈菇消脂丸低劑量組1.620.39±0.10##0.38±0.06

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01；與 鹽酸吡格列酮片組對比，△△P<0.01

A.正常對照組；B.模型對照組；C.鹽酸吡格列酮片組；D.慈菇消脂丸低劑量組；E.慈菇消脂丸中劑量組；F.慈菇消脂丸高劑量組圖1 各組大鼠肝組織NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)對比

正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索、肝竇分布正常，肝細(xì)胞形態(tài)一致。模型對照組大鼠肝被膜增厚，肝細(xì)胞彌漫性水腫和脂肪變性，間質(zhì)少量纖維組織增生。慈菇消脂丸各劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，高、中劑量組肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞散在脂肪變性；低劑量組局灶性肝細(xì)胞水腫、變性，少量炎性細(xì)胞浸潤。鹽酸吡格列酮片組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞散在脂肪變性，少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C慈菇消脂丸高劑量組；D.慈菇消脂丸中劑量組；E. 慈菇消脂丸低劑量組；F.鹽酸吡格列酮片組圖2 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)對比(HE，×200)

3 討 論

研究[7-8]表明，脂肪酸及其代謝產(chǎn)物過度沉積在肝臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞等非脂肪組織可以造成NAFLD和血管功能障礙等疾病。其中FFA是引起脂毒性的重要介質(zhì)，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的脂毒性在NAFLD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著中樞性作用[9]。NAFLD中存在高游離脂肪酸血癥，可促進(jìn)胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而使活性氧水平上升，導(dǎo)致NF-κB的活化和表達(dá)增強(qiáng)，最終引發(fā)炎癥反應(yīng)[10]。同時(shí)，NF-κB還可激活肝臟枯否細(xì)胞，釋放大量活性氧，并增強(qiáng)氧化應(yīng)激，加重肝臟的炎癥反應(yīng)和損傷[11]。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，1986年由Sen和Baltimore 首先發(fā)現(xiàn)廣泛存在于真核細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥遞質(zhì)的表達(dá)和炎癥相關(guān)因子，在氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、肝組織的炎性反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡中起重要作用[12-13]。NF-κB最常見的形式是由p50與p65亞基組成的異二聚體。生理狀態(tài)下，NF-κB與抑制因子IκB單體偶聯(lián)，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在炎癥、缺血缺氧、腫瘤、毒素等多種刺激下，IκB磷酸化后降解，NF-κB二聚體與 IκB 分離，NF-κB得以由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與靶基因序列上特定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)iNOS的過量表達(dá)[14]。高表達(dá)的iNOS產(chǎn)生高濃度的NO，NO可通過多種機(jī)制導(dǎo)致DNA損傷。

NAFLD屬中醫(yī)學(xué)“肥氣”“癥積”“痰濁”范疇。長期嗜食肥甘厚味，飲酒過度；或久臥久坐，體豐痰盈；或七情內(nèi)傷，調(diào)攝失當(dāng)；或因不慎感受濕熱疫毒，使脾失運(yùn)化，肝失疏泄，以致水谷不能化為精微，聚而為濕為痰，化為濕濁脂毒，阻于肝絡(luò)，客于肝臟而形成本病。此符合中醫(yī)學(xué)“濁毒致病”學(xué)說[15]。慈菇消脂丸是課題組自擬的中藥處方。方中山慈菇起化痰解毒、消脂散結(jié)的作用，澤瀉、山楂祛脂化濁，丹參、土鱉蟲逐瘀通絡(luò)，柴胡、黃芩、法半夏疏肝理脾，決明子清肝降脂。整個(gè)組方立法以解毒化痰、消降濁脂為主。課題組前期的研究[16]表明：NAFLD大鼠肝組織中iNOS和NO的表達(dá)量顯著增加；采用慈菇消脂丸干預(yù)后，模型大鼠肝組織脂肪變性程度明顯減輕，iNOS和NO表達(dá)量顯著下降。同時(shí)，課題組另一項(xiàng)研究表明，NAFLD大鼠肝組織中NF-κB表達(dá)顯著增加，且通過線粒體細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，慈菇消脂丸對其有干預(yù)效應(yīng)，但慈菇消脂丸是否通過NF-κB信號通路活化iNOS從而干預(yù)NAFLD肝細(xì)胞脂性凋亡尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，給予不同劑量慈菇消脂丸干預(yù)，以鹽酸吡格列酮片作為陽性對照。結(jié)果顯示：大鼠造模12周出現(xiàn)嚴(yán)重的肝脂肪變性，少量纖維化及肝細(xì)胞凋亡。模型對照組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著高于正常對照組(P<0.01)，除慈菇消脂丸低劑量組對LDL-C表達(dá)無影響外，慈菇消脂丸中、高劑量組及吡格列酮片組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著低于模型對照組(P<0.05)。結(jié)果表明：造模后NAFLD大鼠血清中的脂質(zhì)水平顯著增高，給予慈菇消脂丸灌胃能顯著改善肝功能、降低血脂，具有治療脂肪肝的作用。同時(shí)，模型對照組大鼠比正常對照組NF-κB、iNOS水平均明顯升高(P<0.01)；慈菇消脂丸高、中劑量組及吡格列酮片組均能顯著降低NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)(P<0.01)，且慈菇消脂丸高劑量組在降低NF-κB蛋白方面作用明顯優(yōu)于鹽酸吡格列酮組(P<0.01)。上述結(jié)果說明，慈菇消脂丸具有改善肝功能、降低血脂作用，其作用機(jī)制與調(diào)控NF-κB/iNOS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。