蔣素華 梁 芳 張 燕 周一冉 郭夢園 袁秀云 崔 波*

(1.鄭州師范學院生物工程研究所，鄭州 450044； 2.鄭州大學生命科學學院，鄭州 450002)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)，為多年生附生草本植物，有著藥用價值和悠久的使用歷史[1～2]。我國石斛屬植物共有74種[3]，而鐵皮石斛藥效最佳，但現(xiàn)存與鐵皮石斛近似的其他石斛物種就超過了20余種[4～5]。目前，鐵皮石斛植株及其根、莖、葉的提取物已被廣泛應用于中藥、化妝品等領域，并有著深遠的應用前景。

鐵皮石斛具有典型的單子葉植物根的結構，僅在細胞大小、層次及排列上有所變化[6]；鐵皮石斛的根無主根和側根之分，沒有根毛，根部有菌根真菌共生，與一般的營養(yǎng)根沒有根本差異，根由根被、外皮層、中皮層、內(nèi)皮層、韌皮部、木質部、維管束和髓組成[7]。關于鐵皮石斛對根部切片的研究頗多，而其莖有著重要的藥用價值，所以對莖部的研究仍需推進，莖主要由表皮、薄壁細胞和維管束組成，表皮細胞呈扁平狀，薄壁組織細胞大小區(qū)別顯著，相間排列，維管束為圓形或橢圓形，散布在基本組織中。鐵皮石斛葉片的形態(tài)特征及其結構可以很好的反映它的生長特性，以及對溫度、光照、氧氣等周圍環(huán)境的表達和適應性[8]。總的來說，對鐵皮石斛根、莖、葉顯微結構的研究意義重大。因此，該實驗采用改進的蔗糖保護—液氮速凍冰凍切片法觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結構。與傳統(tǒng)的石蠟切片相比，冰凍切片具有用時短、簡便、易操作等優(yōu)點，并且有利于展開一些關于細胞學領域的研究[9]。此技術解決了利用普通的石蠟切片觀察植物樣品時需要進行浸透、失水、包埋等操作繁瑣、切片用時長的問題。冰凍切片技術已廣泛應用于動物和人體的研究中[10]，但由于植物細胞組織的特殊性，如何在植物的研究中進行應用和推廣變得非常重要。目前，冰凍切片法僅應用于對少數(shù)植物器官和組織切片的研究探索[11]。此外，冷凍后的植物材料因為有大量水分的存在，會比動物材料的硬度大，進而難以獲得較完整的切片，以及難以保持其組織結構的完整性。一般來說，植物的莖部和葉片含水量都較大，而根部含水量相對較少[12]。所以，在以往的很多實驗中，都很難看到完整的莖部和葉片的顯微結構。冰凍切片的研究進展由于還存在許多未知，所以也成為大家密切關注的研究動向。本研究利用光鏡和改進的蔗糖保護—液氮速凍冰凍切片法，觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結構。此方法在直接包埋法冰凍切片的基礎上，加入蔗糖保護液，抽真空，使材料失水，放入液氮中速凍1～2 min，然后才進行包埋切片，減緩了植物材料在低溫環(huán)境的冷凍過程中可能出現(xiàn)的細胞破損、冰晶損傷。此研究將有助于蘭科植物相關基因的亞細胞定位工作的開展，在蘭科植物顯微結構、原位雜交和組織化學研究中將具有廣闊的應用前景。

2 材料與方法

2.1 材料

分別取新鮮鐵皮石斛幼苗期的根、莖、葉作為實驗材料。試驗儀器包括LEICA CM1950冰凍切片機、顯微鏡DM2500(LEZCA)。試驗試劑為液氮、蔗糖、磷酸緩沖液、OCT包埋劑。

2.2 冰凍切片方法的優(yōu)選

2.2.1 不同蔗糖保護液對冰凍切片效果比較

將切取的根分別浸泡在含有4%、8%、16%蔗糖溶液中1 h，分別用對應相同蔗糖質量分數(shù)的磷酸緩沖液進行浸洗4～5次，每次2 min，然后抽真空，直到根沉到管底，之后便直接放到液氮中冷凍30 s，用OCT包埋劑在載物臺上直接包埋，-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度為厚度為15 μm，放進樣品頭中開始切片，分別用干凈的載玻片展片，觀察、比較切片效果，莖和葉處理同上。

2.2.2 不同冷凝溫度對冰凍切片效果比較

將根、莖和葉分別于-15℃、-20℃、-25℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度為厚度為15 μm，分別用干凈的載玻片展片，觀察、比較切片效果。

2.2.3 不同切片厚度對冰凍切片的效果比較

根、莖和葉在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度分別保持在10、15、20 μm，用干凈的載玻片展片，觀察，比較切片效果。

2.2.4 切片評價

切片制作過程中，分別從舒卷度、薄厚度、完整度以及顯微觀察效果四個方面來評價切片的效果，選出最佳切片進行染色(表1)。

2.3 冰凍切片與觀察

將根浸泡在4%蔗糖的溶液中，在-25℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度20 μm；將莖固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度15 μm；切取的葉片先固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度10 μm，分別用干凈的載玻片展片，染色、觀察切片效果。

表1 鐵皮石斛冰凍切片感官評價標準

Table 1 Sensory evaluation criteria for cryo-sectioning ofD.officinale

項目ProjectⅠ級ⅠclassⅡ級Ⅱ classⅢ級Ⅲ classⅣ級Ⅳ class伸卷度Stretch roll degree+++---厚薄度Thickness+++---完整度Integrity+++---顯微效果Effect of microstructure+++---

注：“+”表示切片較舒展、厚度較薄、完整度好以及顯微視覺效果清晰；“-”表示切片卷曲、厚度很厚、完整度差、顯微視覺效果不清晰且嚴重重疊或切片不完整。符號越多，相應的效果越明顯。

Note:“+” means that slices were more stretched,thinner,more complete and had a clear microscopic visual effect. The more “+”,the better the result. “-” means that slices were curl,thickness,poor integrity,unclear microscopic visual effect and serious overlap or incomplete. The more “-”,the worse the result.

3 實驗結果

3.1 不同蔗糖保護液液對冰凍切片的效果比較

分別比較了蔗糖保護液液質量體積分數(shù)為4%、8%、16%的切片效果(圖1)，根在蔗糖固定液濃度為8%時效果較好(圖1A)，細胞正常，無收縮，切片比較完整，能清晰地看到表皮、皮層、維管柱。莖在蔗糖固定液濃度為16%時效果較好(圖1B)，細胞有輕度收縮，切片薄且完整，能清晰地看到表皮、維管束以及薄壁細胞。葉在蔗糖固定液濃度為4%時效果較好(圖1C)，組織結構清晰完整，輕度收縮，能觀察到上下表皮，葉肉細胞和維管束。植物細胞根、莖、葉含水量不同，根的含水量較莖和葉少，莖的含水量和葉片的含水量都很高，而蔗糖可以使其失水，所以根、莖、葉的最適蔗糖固定液濃度分別為8%、16%、4%(表2)。

圖1 不同蔗糖保護液對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.1 Comparison of effects of different sucrose preservatives on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

表2 不同濃度蔗糖保護液的比對

Table 2 Comparison and analysis of sucrose protective solutions with different concentrations

蔗糖保護液Sucrose protectiveliquid(%)完整度Integrity顯微效果Effect of microstructure根Root莖Stem葉Leaf根Root莖Stem葉Leaf4+------+8---+--16--++-+-

注：“++”表示Ⅰ 級；“+”表示Ⅱ級；“-”表示Ⅲ級；“--”表示Ⅳ級 下同。

Note:“++” express Ⅰclass; “+” express Ⅱ class; “-” express Ⅲ class; “--” express Ⅳ class The same as below.

3.2 不同冷凝溫度的冰凍切片效果比較

不同的冷凝溫度對植物組織的包埋穩(wěn)定度影響較大，根在-25℃時包埋穩(wěn)定度最高，切片時不粘連， 不粉碎， 不易卷縮； 莖和葉在-20℃時包埋

表3 不同冷凝溫度對冰凍切片效果比較

Table 3 Comparison of the effect of different condensing temperatures on cryo-sectioning

冷凝溫度Condensing temperature(℃)伸卷度Stretch roll degree根Root莖Stem葉Leaf-15----20++++-25+++-

穩(wěn)定度較高，切片時易伸展，不卷縮。分別比較了不同冷凝溫度下的切片效果(圖2)，根在冷凝溫度為-25℃時效果較好(圖2A)，能清晰地看到顯微結構，如表皮、皮層及維管柱。莖在冷凝溫度為-20℃時效果較好(圖2B)，此時能清晰地看到莖的表皮、薄壁細胞和維管束。葉在冷凝溫度為-20℃時效果較好(圖2C)，圖片較完整，結構較清晰(表3)。

圖2 不同冷凝溫度對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.2 Effects of different condensing temperatures on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

圖3 不同切片厚度對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.3 Effects of different section thicknesses on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

3.3 不同切片厚度的冰凍切片的效果比較

切片厚度直接影響組織的清晰度與完整度(表3)，經(jīng)過比較分析，根的切片厚度保持在20 μm時效果較好(圖3A)，此厚度下的根切片比較完整，結構也清晰。莖在切片厚度保持在15 μm時效果較好(圖3B)，此厚度下的莖可以看到清晰地表皮、維管束、薄壁細胞。葉在切片厚度保持在15 μm時效果較好(圖3C)，此厚度下葉的顯微結構效果較好，清晰且完整(表4)。

表4 不同切片厚度對冰凍切片效果比較

Table 4 Comparison of the effect of different slice thickness on cryo-sectioning

切片厚度Slice thickness(μm)厚薄度Thickness根Root莖Stem葉Leaf10---15++++20---

圖4 鐵皮石斛根的切片效果Fig.4 Effect of root section on D.officinale

3.4 冰凍切片與觀察

鐵皮石斛無主根和側根之分，根的橫切面從外到內(nèi)依次為根被、皮層和中柱。表皮細胞有3～5層細胞，其細胞多呈長筒形，呈45°輻射狀排列。根被主要起吸水、保護、透氣、減少內(nèi)部組織細胞水分流失的作用[13～15]。根被向內(nèi)是皮層組織，由15～16層細胞組成占整個根組織的絕大部分，皮層組織又分為三個皮層：外皮層，內(nèi)皮層、中皮層，根的中心部分稱為中柱，由韌皮部、維管束、木質部和髓組成(圖4)。

鐵皮石斛莖直立多節(jié)、叢生、不分枝、呈圓柱形，通常長9～35 cm，粗3～5 mm，表皮細胞呈扁平狀，皮下層有1列長多角形的細胞，壁較厚。薄壁組織細胞大小區(qū)別顯著，相間排列，維管束為圓形或橢圓形，散布在基本組織中，木質部和韌皮部構成一束束的維管束，分散在薄壁細胞之間(圖5)。

鐵皮石斛葉的表皮細胞呈不規(guī)則多邊形，上表皮細胞較下表皮細胞大，葉肉組織分布均一，葉肉細胞含大量葉綠體，葉片為平行葉脈，葉脈為大維管束，維管束外均分布有一層小型薄壁細胞(圖6)。

圖5 鐵皮石斛莖的切片效果Fig.5 Effect of stem section on D.officinale

圖6 鐵皮石斛葉的切片效果Fig.6 Effect of leaf section on D.officinale

4 討論

冰凍切片可以縮短常規(guī)石蠟切片緩慢而復雜的處理過程，減少對樣品組織活性物質的損傷，更好地保存生物分子活性，且具有快速、簡便、易操作等特點[16]。在實驗中，采用改進的蔗糖保護—液氮速凍冰凍切片法觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結構，從而確定出鐵皮石斛根、莖、葉冰凍切片的最適條件：根在蔗糖固定液濃度為4%，冷凝溫度為-25℃，切片厚度保持在20 μm時效果較好；莖在蔗糖固定液濃度為16%，冷凝溫度為-20℃，切片厚度保持在15 μm時效果較好；葉在蔗糖固定液濃度為16%，冷凝溫度為-20℃，切片厚度保持在10 μm時效果較好。

植物細胞具有大液泡，植物細胞中大量的水分使植物樣品更容易在低溫冷凍過程中形成冰晶，損傷植物細胞的細微結構，即“冰晶損傷”[17]，對于植物組織來說，蔗糖是一種很好的固定液，蔗糖可以使植物細胞失水，液氮可以及時速凍，在細胞失水之后盡量減輕因冷凍造成的冰晶損傷；快速冷凍是解決這一問題的主要措施之一，而使用冷凍保護劑可以降低細胞內(nèi)溶液的冰點，減小形成冰晶的機會[18]。陳丹等[19]對煙草頂芽冰凍切片的研究表明，蔗糖濃度為40%時，雖然芽整體結構保持較完整且分生組織不受影響，但分生組織周圍的薄壁細胞卻有不同程度收縮，本研究采用4%～16%的蔗糖濃度，得到了良好的效果。實驗采用改進的蔗糖保護—液氮速凍冰凍切片法，對鐵皮石斛的根、莖、葉的顯微結構進行觀察、分析、總結，可進一步為鐵皮石斛的結構和植物學鑒定提供參考，同時也為蘭科基因組織差異表達和定位，以及原位雜交與組織化學染色提供冰凍切片的關鍵技術。