肖美芳，林樟萍，陸喆，劉乾坤

（海南省婦幼保健院 檢驗科，海南 ?？?570206）

降鈣素相關(guān)基因肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）是由感覺神經(jīng)元釋放的一種肽類物質(zhì)[1]。已有研究證實CGRP 具有顯著的抗炎效果[2-3]，其通過抑制T 淋巴細胞的增殖，并且抑制巨噬細胞產(chǎn)生促炎因子，從而調(diào)節(jié)炎癥反應[4]。核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotides binding oligomer domain like receptors 3,NLRP3）作為炎癥反應中的炎癥小體[5]，主要在外周單核巨噬細胞和腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中表達[6]?；钚匝醮兀╮eactive oxygen species,ROS）被認為是最重要的激活炎癥小體NLRP3 的因素[7-8]。NLRP3 炎癥小體在ROS激活后能夠活化半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），使炎癥因子成熟并釋放到胞外以發(fā)揮作用[9]。因此可推測CGRP 可能作為調(diào)控者通過ROS 使NLRP3 活性降低，從而減少局部炎癥反應?；诖耍狙芯繉υ撏茰y進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

大腸桿菌0111：B4 的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（美國Sigma 公司），CGRP（南京肽業(yè)生物科技有限公司），兔抗NLRP3、Caspase-1、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗體（美國Santa 公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），Taq Man逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Life Technologies 公司），小鼠源性IL-1β 和TNF-α 的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢 測試劑盒（美國EXCEL 公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒（美國Gene Copoeia 公司），Bio Rad IQTM 5 Multicolor 實時熒光定量系統(tǒng)（美國Bio Rad 公司），紫外可見分光光度計（美國Thermo 公司，型號Nanodrop 2000），Multiskan MK 3 酶標儀（美國Thermo），F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細胞儀（美國BD），倒置熒光顯微鏡Nikon IX71，Image-Pro Plus 7.0 成像系統(tǒng)（日本Olympus 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理方法

RAW264.7 巨噬細胞（中國科學院上海細胞庫），所用培養(yǎng)液為含10% FBS（杭州四季青生物材料有限公司），含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長至匯合度為80%～90%時換1 次液，此時顯微鏡下觀察到巨噬細胞生長形態(tài)正常，呈梭形，半貼壁生長（見圖1）。實驗分為對照組、脂多糖（LPS）100 ng/ml 組（LPS 組）、CGRP 10 ng/ml組（CGRP 10組）、CGPR 30 ng/ml組（CGRP 30 組）、CGRP 100 ng/ml 組（CGRP 100 組）和CGRP 30 ng/ml+LPS 100 ng/ml 組（CGRP 30+LPS 組），加LPS或CGRP 處理前將FBS 含量降至0.5%。每組設(shè)3 個 平行樣，重復3 次。RAW264.7 巨噬細胞以5×104個/ml，接種于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中（總體積為10 ml），培養(yǎng)24 h，經(jīng)LPS 和CGRP 刺激后，收集細胞及培養(yǎng)上清液用于后續(xù)實驗。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR 檢測

各加100 μl Trizol 裂解液到6 孔板中，常溫靜置后加入氯仿140 ml，劇烈搖晃15 s，12 000 r/min 低溫離心15 min，。取上層液體置于干凈EP 管中，加入異丙醇，混勻后室溫放置10 min。繼以轉(zhuǎn)速7 500 r/min，4℃離心5 min 去上清。采用1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于30 μl 無酶水，檢測RNA 濃度，剩余RNA 放入冰箱保存?zhèn)溆?。采用紫外可見分光光度計測定A260/A280 比值，當比值在1.8 ～2.0 時表示所提取的RNA 可用于后續(xù)實驗。以提取的細胞總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA 為模板，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫應用引物表達-2 軟件設(shè)計引物序列，CGRP（M34090）正向引物：5'-GAGGCAGCTA CAAGGTTCAGG-3'，反向引物：5'-AGGTGTTGGTGCT GGACACA-3'。管家基因GAPDH為內(nèi)參，正向引物：5'- GGCCTTCCGTGTC-CTACC-3'，反向引物：5'-CGGCAT GTCAGATCCACAAC-3'。PCR 反應體系10 μl，反 應條件：50℃預變性3 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共循環(huán)40 次，反應結(jié)束后采用分離曲線法確定反應產(chǎn)物的特異性。實驗數(shù)據(jù)分析采用實時定量PCR 循環(huán)閾值Ct（cycle threshold,Ct）比較法，以管家基因GAPDH 的CT 為內(nèi)參，mRNA 相對表達量為同一個樣本CGRP mRNA 的Ct 值與GAPDH mRNA 的Ct 值之比。經(jīng)實時熒光定量系統(tǒng)檢測并記錄實驗結(jié)果。所有引物均由美國Invitrogen 公司合成，其中GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt用于計算相對表達量，ΔΔCt=（Ct基因-CtGAPDH）目的基因-（Ct基因- CtGAPDH）內(nèi)參基因。每個樣品設(shè)置3 個復孔，反應體系為20 μl。

1.4 ELISA 檢測

收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA 檢測試劑盒的說明書檢測上清液中IL-1β 和TNF-α 的表達。按說明書的要求準備樣品并將其加入試劑盒配套的96 孔板中，隨后加IL-1β 和TNF-α 抗體孵育。用洗滌液洗凈，加顯色底物及酶結(jié)合工作液、加終止液并混勻。最后在酶標儀上檢測450 nm 處的吸光度值并記錄。據(jù)此繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算并記錄樣品中IL-1β 和TNF-α 的濃度。

1.5 蛋白提取和Western blotting

提取各組細胞總蛋白，采用PBS 緩沖液沖洗2 次，加入1 ml RIPA 蛋白裂解液，充分接觸后刮下細胞，搖動30 min 使細胞完全裂解，12 000 r/min 離心5 min后收集上清液，BCA 法檢測各組細胞的蛋白濃度。分別取30 μg 樣本進行SDS-PAGE 凝膠電泳實驗，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1 ～2 h，加入1∶10 000 的兔抗人NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α 及1∶1 000 兔抗人β-actin 抗體，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入1∶1 000 的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。加入ECL 發(fā)光劑后保存條帶圖片。以目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平，每組實驗設(shè)置3 個復孔。

1.6 流式細胞術(shù)檢測ROS 水平

將RAW264.7 巨噬細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，按實驗分組分別給予不同濃度的CGRP 或LPS 處理。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)基，消化離心收集細胞放入EP 管，PBS 洗1 次，用無血清培養(yǎng)液按1 000∶1 配制DCFH-DA，每個樣本加1 ml 工作液重懸。將EP 管放入培養(yǎng)箱，孵育30 min，每隔3 ～5 min 顛倒混勻1 次，離心收集細胞，PBS 洗3 次，棄上清，1 ml PBS 重懸后上機檢測（美國FACScan 公司，BD）（激發(fā)光為氬離子激光，488 nm）。最后在流式細胞儀檢測、FlowJo 軟件（Tree Star）分析并繪制曲線。各組所檢測的活細胞數(shù)均≥×104個。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 的表達水平比較

6 組IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.649、11.439 和17.502，均P=0.000）。與對照組比較，LPS 組IL-1β、TNF-α、NLRP3 mRNA 的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.675、2.631 和3.121，P=0.001、0.022 和0.009）；與LPS 組比較，CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組 的IL-1β、TNF-α 和NLRP3 的mRNA 表達水平均降低（IL-1β：t=8.483、10.591、7.363 和6.335，均P=0.000；TNF-α：t=4.369、6.767、5.726 和3.955，P=0.001、0.000、0.000 和0.002；NLRP3：t=6.374、8.640、5.546和4.335，P=0.000、0.000、0.000 和0.001），且CGRP 30 組最低。見表1 和圖2。

2.2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平比較

6 組IL-1β 和TNF-α蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.564 和30.796，均P=0.000）。LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.351 和7.886，均P=0.000），LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平升高。CGRP10 組、CGRP30 組、CGRP100 組、CGRP30+LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平與LPS 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（IL-1β：t=6.464、7.172、5.495 和2.642，P=0.000、0.000、0.000 和0.021；TNF-α：t=9.563、10.542、8.133 和4.315，P=0.000、0.000、0.000 和0.001），CGRP10 組、CGRP30 組、CGRP100 組、CGRP30+LPS 組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平均降低，且CGRP30 組最低。見表2 和圖3。

表1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達水平的比較 （±s）

表1 各組IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與LPS 組比較，P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α NLRP3對照組 1.00±0.15 1.01±0.29 1.00±0.20 LPS 組 1.62±0.321) 1.46±0.191) 1.29±0.051)CGRP10 組 0.50±0.102) 0.71±0.252) 0.71±0.052)CGRP30 組 0.22±0.052) 0.30±0.242) 0.50±0.142)CGRP100 組 0.65±0.112) 0.48±0.102) 0.78±0.012)CGRP30+LPS 組 0.78±0.102) 0.78±0.112) 0.89±0.102)F值 26.649 11.439 17.502P值 0.000 0.000 0.000

圖2 CGRP 對細胞中IL-1β、TNF-α 和NLRP3 mRNA 表達水平的影響 （±s）

表2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平的比較 （±s）

表2 各組IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與LPS 組比較，P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α對照組 389.82±157.83 384.29±132.61 LPS 組 812.98±51.011） 811.61±32.111）CGRP10 組 300.76±95.102） 294.77±59.862）CGRP30 組 241.40±83.732） 240.76±30.522）CGRP100 組 375.29±97.382） 369.85±59.272）CGRP30+LPS 組 606.46±73.052） 581±24.312）F值 14.564 30.796P值 0.000 0.000

圖3 CGRP 對細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α 蛋白 表達水平的影響 （±s）

2.3 各組細胞的ROS 水平比較

6 組ROS 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=52.623，P=0.000）。LPS 組ROS 水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.368，P=0.000），LPS 組ROS水平升高。CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組ROS 水平與LPS 組比較，差異均 有統(tǒng)計學意義（t=8.496、14.197、6.741 和5.593，均P=0.000），CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組ROS 水平均降低，且CGRP30 組最低。見表3 和圖4。

2.4 各組ROS-NLRP3 信號通路相關(guān)蛋白的表達

6 組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=58.374、62.779、127.711 和114.531，均P=0.000）。與對照組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平比較，LPS 組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水平均升高（t=13.557、13.815、23.863 和18.779，均P=0.000），與LPS 組比較，CGRP 10 組、CGRP 30 組、CGRP 100 組、CGRP 30+LPS 組的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表達水 平均降低（NLRP3：t=9.164、14.692、12.729 和11.964，均P=0.000；Caspase-1：t=10.047、15.045、13.952 和12.454，均P=0.000；IL-1β：t=10.173、14.920、9.185 和7.321，均P=0.000；TNF-α：t=10.958、19.548、18.140 和17.222，均P=0.000），且CGRP30 組最低。見表4 和圖5。

表3 各組ROS 水平的比較 （%，±s）

表3 各組ROS 水平的比較 （%，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與LPS 組比較，P＜0.05

組別 ROS對照組 33.24±1.81 LPS 組 37.80±1.991）CGRP10 組 21.91±2.932）CGRP30 組 11.25±1.982）CGRP100 組 25.19±3.242）CGRP30+LPS 組 27.34±1.132）F值 52.623P值 0.000

圖4 CGRP 對細胞內(nèi)ROS 水平的影響

表4 各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平的比較 （±s）

表4 各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與LPS 組比較，P＜0.05

組別 NLPR3 Caspase-1 IL-1β TNF-α對照組 0.62±0.10 0.90±0.08 0.61±0.15 0.41±0.12 LPS 組 2.12±0.201） 2.00±0.121） 3.21±0.081）3.03±0.291）CGRP10 組 1.10±0.152） 1.20±0.092） 2.10±0.142）1.50±0.222）CGRP30 組 0.50±0.082） 0.81±0.122） 1.58±0.192）0.30±0.082）CGRP100 組 0.71±0.152） 0.89±0.082） 2.21±0.122）0.50±0.112）CGRP30+ LPS 組 0.80±0.082） 1.01±0.082） 2.41±0.082）0.63±0.102）F值 58.374 62.779 127.711 114.531P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 細胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和TNF-α 蛋白的表達

3 討論

炎癥反應常常是由抗原或異物的入侵、感染等引起的，該過程中會釋放多種生物活性物質(zhì)[10]。腦損傷時巨噬細胞和中性粒細胞常在發(fā)生損傷的部位聚集，另外血漿蛋白也會在損傷部位產(chǎn)生免疫反應[11]。炎癥反應也可引發(fā)多種包括無病原體感染的肥胖、心血管疾病、糖尿病或癌癥等。炎癥反應可產(chǎn)生于機體各組織、器官的常見臨床病理過程，是機體與致炎因子進行抗爭的規(guī)律反應[12]。以炎癥反應常發(fā)生的骨折愈合過程為例，在骨折愈合的血腫機化期，大量炎癥細胞浸潤，開始吞噬和清除壞死組織，同時骨折處的骨外膜增殖分化成骨細胞使血腫機化[13]。巨噬細胞是主要免疫細胞之一，NLRP3 是感官病原體和危險信號的多蛋白復合物。免疫細胞中的NLRP3 活化可激活Caspase-1，進一步誘導IL-1β 和TNF-α 等下游炎癥因子的加工與釋放。而T 細胞、NF-κB 和MAPK等信號通路均可被成熟的IL-1β 活化，啟動先天性免疫應答，從而清除病原體。即在宿主先天性免疫反應中NLRP3 活化發(fā)揮極其重要的作用[14-15]。

NLRP3 炎癥復合體能被多種激活劑激活，而活性氧ROS 則是激活NLRP3的關(guān)鍵。已有研究表明線粒體內(nèi)ROS 是調(diào)控NLRP3 活化的關(guān)鍵，ROS 生成過程若發(fā)生自吞噬抑制，則NLRP3 激活被抑制，自吞噬過程被抑制或發(fā)生障礙則NLRP3 被激活。此外，炎癥細胞同時分泌大量的細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-β 等，刺激成纖維細胞增殖分化、膠原蛋白及血管生成[16]。而促炎因子如IL-1β、TNF-α 的過表達可顯著延長炎癥期及創(chuàng)面愈合的時間[17]。因此尋找抑制ROS-NLRP3 通路的分子將可能抑制促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的釋放，從而為臨床各種炎癥反應的治療提供新的思路。

CGRP 為典型的神經(jīng)肽類，在加速骨折愈合中扮演著關(guān)鍵的角色，其對骨細胞有促進作用[18]。本研究分別以不同濃度的CGRP 處理小鼠來源的巨噬細胞RAW264.7，檢測CGRP 對NLRP3 炎癥復合體及其下游通路相關(guān)的炎癥因子活化的影響。通過與對照組或LPS 組的比較，反映出細胞或培養(yǎng)上清中NLRP3、IL-1β、TNF-α 或ROS 水平的變化，驗證CGRP 可抑制細胞內(nèi)及細胞上清中炎癥復合體NLRP3 mRNA及蛋白表達水平，以及抑制ROS-NLRP3 通路下游相關(guān)的炎癥因子或蛋白IL-1β、TNF-α 和Caspase-1的mRNA 和蛋白表達，且參與抑制細胞內(nèi)ROS 水平的變化過程。以上研究結(jié)果與AUBDOOL[19]和李翔等[20]的研究相一致，即巨噬細胞中CGRP 也可通過調(diào)控細胞內(nèi)ROS 使NLRP3 的活性降低，從而使ROS-NLRP3信號通路下游的IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子的釋放減少，下游通路相關(guān)蛋白Caspase-1 的表達降低，從而可能在減少局部炎癥反應中起到重要作用。

綜上所述，本研究初步闡明CGRP 對NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子激活的調(diào)節(jié)作用，該研究可能為如何減少炎癥反應（如加快骨折愈合、傷口愈合等）提供新的臨床治療思路。