徐芳，王愛利

（武漢市第一醫(yī)院 呼吸科，湖北 武漢 430022）

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是一種病因未明、發(fā)病機制復雜的彌漫性肺部疾病[1]，目前公認是肺損傷后過度修復導致細胞外基質過度沉積的結果。課題組前期研究顯示，肺纖維化中輔助性T 細胞17（T helper cell 17,Th17）的高表達與肺纖維化進展呈正相關[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，NOTCH 信號通路在肺纖維化中被激活，促進成纖維細胞表型轉化[3]，加重細胞外基質的沉積。Th17 高水平分泌和表達白細胞介素-17（Interleukin 17,IL-17）的過程受多種信號通路的調控。有研究表明，在小鼠和人促Th17 細胞分化的細胞因子環(huán)境中均有NOTCH 信號通路的活化[4]。本研究采用γ-分泌酶抑制劑DAPT 阻斷NOTCH 信號通路，探討NOTCH 信號通路對肺纖維化模型小鼠Th17細胞的影響，為肺纖維化治療尋找新的免疫靶向藥物提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取15 只雄性昆明鼠（批號：42000600006205），體重約25 ～30 g，購自武漢大學動物中心；博來霉素（4 mg/支，天津太和制藥有限公司，批號：081102），DAPT（美國Sigma 公司），鼠α- 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、NOTCH 1 及IL-17 等相關抗體（美國Santa Crue 公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國R &D 公司），Quantscript RT Kit 逆轉錄試劑盒（大連TaKaRa 公司），SYBR Green/Floursecein試劑盒（立陶宛Fermentas 公司），異硫氰酸熒光素標記的CD3、CD4 抗體及藻紅蛋白標記的IL-17A 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）。

1.2 動物模型的復制及實驗分組

按隨機數(shù)字表法分為3 組：對照組、模型組及DAPT組，每組5只。各組小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射，麻醉后固定于手術臺上，頸部氣管切開注藥。對照組注入生理鹽水（1.25 ml/kg）設立陰性對照，模型組及DAPT 組注入博來霉素（5 mg/kg），DAPT 組于模型復制次日起開始用DAPT 溶液灌胃[5 mg/（kg·d）]，隔天1 次，直到處死。

1.3 肺組織病理學觀察

各組小鼠于模型復制第28 天處死，取左肺相同部位組織，用4%甲醛固定，常規(guī)病理學方法脫水、包埋、切片、HE 染色，觀察肺泡炎和肺纖維化程度。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測肺組織中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA的表達水平

取50 mg大小的肺組 織，用Trizol法提取總RNA。各樣本取相同質量的RNA 逆轉錄成cDNA，qRT-PCR 檢測NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA 的表達水平。反應體系中的引物均由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司設計。循環(huán)參數(shù)：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。共40個循環(huán)。見表1。

表1 引物序列

1.5 ELISA 檢測外周血NOTCH 1、IL-17 的含量

各組小鼠于處死日心包取血，應用ELISA 檢測各組小鼠外周血上清中NOTCH 1 及IL-17 的含量。參照試劑盒說明書步驟進行操作，最后經(jīng)酶標儀在450 nm處讀取吸光度值，并在標準曲線上計算其濃度值。

1.6 流式細胞術檢測Th17 的比例

各組小鼠處死日心包取血3 ml，用小鼠淋巴細胞分離液分離外周單個核細胞。取培養(yǎng)后細胞懸液100 μl 于流式管中，加固定液、孵育、破膜、重懸細胞，用CD3-FITC 抗體、CD4-FITC 抗體、IL-17-PE-A 單克隆抗體標記，逐步挑選出CD3+CD4+IL-17+3 種陽性細胞上流式細胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關分析采用Pearson法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學變化

對照組肺組織肺泡間隔正常，肺泡的連續(xù)性未受到破壞，肺泡的直徑和面積大小均勻，大部分區(qū)域終末小氣道及血管周邊無明顯炎癥浸潤表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)纖維化形成。模型組肺泡間隔增寬，肺泡的連續(xù)性受到破壞，肺泡大小不均勻，終末小氣道及血管周邊有明顯的炎癥細胞浸潤，同時伴有纖維化形成，纖維化以支氣管周邊區(qū)域較為明顯。DAPT 組與模型組比較，肺組織結構比較完整，肺組織炎癥程度明顯減輕，肺泡腔內殘留少量炎癥細胞，肺泡間隔明顯縮小，纖維組織明顯減少。見圖1。

2.2 肺組織中NOTCH 通路的激活對IL-17 的影響及DAPT 對其阻斷效應

3 組NOTCH 1 mRNA的相對表達水平分別為（1.023±0.112）、（4.278±1.021）和（1.876±0.114），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.129，P=0.000）；3 組α-SMA mRNA 的相對表達水平分別為（1.012±0.087）、（2.378±0.998）和（1.687±0.092），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.448，P=0.001）；3組IL-17 mRNA 的相對表達水平分別為（1.232±0.778）、（5.198±1.265）和（2.729±1.123），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.676，P=0.024）。見圖2、3。

圖1 各組小鼠組織病理學改變 （HE×200）

2.3 DAPT 對肺纖維化小鼠外周血NOTCH 1、IL-17 表達水平的影響

3 組NOTCH 1 和IL-17 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；DAPT 組外周血IL-17 和NOTCH 1 的表達水平較模型組下降（P ＜0.05）。見表2。

2.4 NOTCH 1 與IL-17 的相關性

Pearson 相關分析顯示，肺組織中NOTCH 1 mRNA水平與IL-17 呈正相關（r=0.643，P=0.031），DAPT組外周血Th17 的下降與NOTCH 1 呈正相關（r=0.602，P=0.033）。

2.5 各組Th17 比例

對照組、模型組及DAPT 組CD3+CD4+IL-17+細胞比例分別為0.44%、19.10%和8.92%，3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.067，P=0.036）。見圖4。

圖2 肺組織中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA 的表達

圖3 各組肺組織中NOTCH 1、IL-17 及α-SMA mRNA的表達水平 （n=5，±s）

表2 各組血清中NOTCH 1 及IL-17 表達水平的比較 （n=5，±s）

表2 各組血清中NOTCH 1 及IL-17 表達水平的比較 （n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 NOTCH 1 IL-17對照組 41.35±4.23 23.43±3.27模型組 98.78±5.321） 78.45±4.431）DAPT 組 62.13±3.892） 42.00±4.072）F值 15.876 16.253P值 0.008 0.001

圖4 Th17 流式細胞分析

3 討論

肺纖維化的發(fā)病機制不明，目前公認為肺泡上皮反復損傷與過度修復是發(fā)病的關鍵[5]。反復損傷的肺泡上皮細胞一方面分泌大量的轉化生長因子β1（TGF-β1）、血小板衍生因子等炎癥細胞因子，誘導成纖維細胞聚集及肌成纖維細胞的形成，特異性表達α-SMA；另一方面發(fā)生上皮-間充質轉化，通過以TGF-β1為主的多種復雜途徑調控疾病的發(fā)生、發(fā)展。在炎癥反應過程中，T 細胞的免疫應答很關鍵。近年來發(fā)現(xiàn)的Th17/調節(jié)性T 細胞（regulatory cell,Treg）在功能和分化上相互拮抗、相互調節(jié)[6]。Th17 是以分泌IL-17 為特點的新型CD4+T 淋巴細胞的亞群。當免疫系統(tǒng)受到外源性的刺激后，炎癥細胞釋放的TGF-β和IL-6 誘導CD4+T 淋巴細胞轉化成為Th17，分泌IL-17 并表達RORγt。在生理狀態(tài)下兩者保持動態(tài)平衡維持機體正常免疫功能及自穩(wěn)狀態(tài)[7]，而一旦受到外界刺激后，這種平衡就發(fā)生紊亂，例如慢性阻塞性肺疾病患者不管是急性發(fā)作期還是緩解期都存在著CD4+T 細胞亞群的失衡[8]。本研究顯示，模型組小鼠肺組織呈現(xiàn)明顯纖維化表現(xiàn)，且外周血IL-17 的含量及肺組織中IL-17 的表達較對照組升高，說明IL-17活化加重肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。同時，CD3+CD4+IL-17+細胞數(shù)量增加，比例升高，提示這種平衡向Th17 方向漂移。

如果能抑制Th17 細胞介導的這一促炎癥反應過程，在一定程度上穩(wěn)定免疫內環(huán)境，可能達到抑制肺纖維化的作用。

有研究表明，NOTCH 信號通路能夠上調小鼠胸腺及外周Treg 的數(shù)量并維持其轉錄因子Foxp3 的表達[9]。經(jīng)典NOTCH 信號通路的激活主要是通過相鄰細胞間的NOTCH 受體與配體的結合啟動，誘導受體構型發(fā)生改變，受體的細胞外段被基質金屬蛋白酶切割，γ-分泌酶裂開并釋放NOTCH 胞內段（NICD），進而NICD 遷移到細胞核內，與下游效應蛋白CSL 結合，激活NOTCH 靶基因的轉錄[10-11]，從而發(fā)揮促進細胞增殖、抑制細胞分化等生物學功能[12]。研究表明，NOTCH 信號的激活主要取決于γ-分泌酶的活性，DAPT 能夠阻斷NOTCH 受體活化的中心環(huán)節(jié)，使NOTCH 受體分子無法進一步轉變?yōu)橛行У幕钚云?，進而完全阻斷NOTCH 信號通路的激活[13]。有研究表明，在小鼠促Th17 分化的細胞因子環(huán)境中有NOTCH信號分子的活化，阻斷NOTCH 信號通路則明顯下調Th17 細胞相關細胞因子的產(chǎn)生，減輕Th17 細胞及其效應細胞因子IL-17A 介導的炎癥，且NOTCH 信號能直接調控Th17 細胞特異轉錄因子RORγt 的表達[14]。在哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘患兒外周血中IL-17含量增加，Th17/Treg 細胞失調，這種變化伴隨著NOTCH1 的高表達，說明Th17 活化與NOTCH 的激活有關[15]。

本研究模型組中NOTCH1 表達增加，提示NOTCH信號通路在肺纖維化中激活，與Th17 相關。用DAPT抑制NOTCH 信號途徑后，DAPT 組IL-17 的mRNA 及外周血水平均降低，與NOTCH1 呈正相關。上述結果表明，NOTCH 信號通路的激活可能促進T 細胞向Th17分化，DAPT 抑制NOTCH 信號則抑制Th17 細胞的活化。

NOTCH 信號通路較為復雜，不同的NOTCH 受體和配體結合對T 細胞亞型的分化及細胞因子的分泌出現(xiàn)不同的效應，加之NOTCH 與其他信號通路間有多維調控網(wǎng)絡，使得目前NOTCH 信號通路對T 細胞調控的具體機制尚存在一定的爭議。COUTAZ 等[16]認為，在一般情況下，NOTCH 負調節(jié)Th17 細胞的分化，但機體受到外界刺激時，NOTCH 能通過影響胞內細胞因子的轉運而加速Th17 細胞因子的釋放，從而抵消原有的效應，因此認為NOTCH 信號作用的發(fā)揮具有環(huán)境依賴性。而BAILIS 等[17]則認為雖然環(huán)境狀態(tài)會影響基因表達的擴增，但NOTCH 調控關鍵轉錄因子的能力并無改變。即使在強極化條件下，NOTCH 也能直接調節(jié)T 細胞分化的關鍵轉錄因子，NOTCH 信號通過增強CD4+T 細胞各亞群的環(huán)境敏感性而對其亞群產(chǎn)生無偏移擴增。

本研究只是初步探討肺纖維化動物模型中NOTCH 信號對Th17 的影響，將進一步深入靶向研究，了解更多的肺纖維化的發(fā)病機制。