余建林，譚立明，蔣永清，吳瓊，陳娟娟，李華，吳洋，曾婷婷，田永建

[南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科（江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）江西 南昌 330006]

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種自身免疫性疾病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)及中軸關(guān)節(jié)，病因目前仍不明確[1]。目前AS 的診斷主要依靠影像學(xué)結(jié)合臨床表現(xiàn)，其早期診斷和治療受到限制，明確診斷時(shí)多為中晚期，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此，早期診斷AS 具有重要的臨床意義。臨床工作中發(fā)現(xiàn)南昌地區(qū)漢族人群AS 患者HLA-B27 陽性率高于其他疾病人群。有文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]AS 患者HLA-B27基因具有高陽性率和多種基因亞型，地區(qū)和人群間存在差異，對(duì)AS 的早期診斷有一定意義。本研究選取南昌地區(qū)漢族人群AS、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）、腰椎盤間盤突出（lumbar intervertebral disc herniation,LIDH）、脊柱結(jié)核（spinal tuberculosis,ST）和骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）等患者及健康體檢者進(jìn)行HLA-B27基因亞型分析，為該地區(qū)AS 的早期診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1 ～12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診及住院AS 患者74 例（AS 疾病組）。其中，男性49 例，女性25 例；年齡17 ～63 歲，平均（31.88±3.19）歲。RA 患者65 例。其中，男性18 例，女性47 例；年齡22 ～66 歲，平均（36.88±2.59）歲。LIDH 患者51 例，其中，男性27 例，女性24 例；年齡18 ～67 歲，平均（31.65±2.78）歲；ST 患者50 例。其中，男性27 例，女性23 例；年齡17 ～66 歲，平均（30.49±3.78）歲；OA 患者53 例。其中，男性23 例，女性30 例；年齡24 ～67 歲，平均（34.84±2.14）歲?；颊呔习亓衷\斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。健康體檢人群40 例（健康對(duì)照組）。其中，男性18 例，女性22 例；年齡16 ～67 歲，平均（31.45±2.78）歲。所有研究對(duì)象均為南昌地區(qū)漢族人群。各組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。將RA 和OA 合并為關(guān)節(jié)炎癥疾病（關(guān)節(jié)炎癥疾病組），LIDH 和ST 合并為非關(guān)節(jié)炎癥性脊柱疾?。ǚ顷P(guān)節(jié)炎癥脊柱疾病組）。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有血液樣本均在患者知情同意條件下獲得。

1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur（上海智巖科學(xué)儀器有限公司），PCR 儀器ABI2720（南京貝登醫(yī)療股份有限公司），ABI 3730XL 測(cè)序儀（上海佰真生物科技有限公司），配套的分析軟件為Accu Type。HLA-B27抗原檢測(cè)試劑：FITC 標(biāo)記的抗-HLA-B27、PE 標(biāo)記的抗-CD3、溶血素；HLA-B27基因亞型測(cè)定試劑：TBG Biotechnology Corp HLAssure 試劑盒（臺(tái)灣基亞生物科技股份有限公司），SE SBT kit 批號(hào)分別為AA15111K，AB15111K，AC15111K，AX15111K，AQ15111K。制備DNA 模板試劑：EXTRA-GEN 試劑盒（鹽析，上海信帆生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HLA-B27 檢測(cè)①取抗-HLA-B27 FITC/CD3 PE 試劑30 μl 與50 μl 充分混勻的抗凝血（確保白細(xì)胞的濃度在3.5×103～9.4×103個(gè)/μl）混勻后室溫避光靜置15 ～20 min；②混勻靜置后的血液中加入2 ml 的溶血素，混勻避光室溫靜置10 ～12 min；③靜置后的血液離心吸取上清液后，留取約50 μl 細(xì)胞液加入2 ml PBS 洗滌細(xì)胞；④向洗滌后的細(xì)胞加入0.25 ml 1% 甲醛固定30 min；⑤將染色好的細(xì)胞在BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，操作方法及結(jié)果判斷均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)文件進(jìn)行。

1.3.2 HLA-B27基因亞型檢測(cè)采用PCR-SBT 技術(shù)分析AS 患者及健康對(duì)照人群HLA-B27基因亞型。①DNA 模板制備：為保證測(cè)序所得結(jié)果的可靠性，將DNA 在260 nm 處吸光度與280 nm 處吸光度（A260/ A280）的比值控制在1.65 ～1.80。②PCR 擴(kuò)增：TBG Biotechnology Corp HLAssure SE SBT kit試劑盒； 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；93℃變性30 s，63℃退火40 s，72℃延伸2.5 min，共36 個(gè)循環(huán)。72℃再延伸5 min；降溫至4℃，完成PCR 擴(kuò)增。③凝膠制備：依據(jù)制膠系統(tǒng)操作說明書，配置2%瓊脂糖凝膠加入溴化乙錠，使溴化乙錠濃度為0.5 μg/ml；在10 V/cm 的電壓條件進(jìn)行跑膠，直到甲酚紅到達(dá)距離膠上緣1.4 ～2.0 cm 處。④PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分析：紫外光觀察箱觀察，再使用影像分析系統(tǒng)確認(rèn)PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量。⑤基因亞型分析：5 μl 特異性測(cè)序反應(yīng)體系（其中含有HLA-B27 的特異性正反向引物，正向引物：5'-GGTCCAAGACGAGGAGGTTC-3'；反向引物：5'-GGTGGGACAGGAATTAG-3'）。測(cè)序反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性2 min；96℃變性10 s；50℃退火5 s；60℃延伸4 min，共25 個(gè)循環(huán)。在純化測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物后使用熒光標(biāo)記雙脫氧法測(cè)序運(yùn)用PCR-SBT 技術(shù)進(jìn)行HLA-B27基因亞型分析檢測(cè)，使用配套的分析軟件Accu Type 分析HLA-B27等位基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用χ2分割法進(jìn)行組間兩兩比較，校正后α=0.007，P＜0.007 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組HLA-B27 人群分布 例（%）

2 結(jié)果

2.1 HLA-B27 檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞儀HLA-B27 檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 HLA-B27 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 HLA-B27 表達(dá)分布情況及分型

AS 疾病組HLA-B27 陽性率與關(guān)節(jié)炎癥疾病組、非關(guān)節(jié)炎癥性脊柱疾病組及健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=183.54，P=0.000），AS 疾病組高于其他3 組。見表1。

2.3 HLA-B27 陽性人群性別及年齡分布

30 ～＜40 歲年齡人群中男性人群的HLA-B27 陽性率為46.55%，高于女性人群23.08%（χ2=5.506，P=0.016）。見表2。

表2 HLA-B27 陽性人群年齡及性別的分布

2.4 HLA-B27 陽性人群不同疾病及性別分布

AS 疾病組中男性人群的HLA-B27 陽性率為87.76%，高于其他組別的男性人群陽性率（χ2=103.150，P=0.000）；女性人群HLA-B27 陽性率為84.00%，高于其他組別的女性人群的陽性率（χ2=75.450，P=0.000）。見表3。

2.5 HLA-B27基因亞型分析

AS 疾病組HLA-B27基因亞型分為B2704 48 例、B2705 14 例、B2707 1 例、B2709 1 例；非AS 疾病組與健康體檢人群HLA-B27 基因各亞型陽性人數(shù)少，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，合并后再與AS 疾病組各基因亞型比較，其中與B2704、B2706 和B2709 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.153、32.919 和21.162，均P=0.000）。而與B2705 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.414，P=0.056）。見表4 和圖2。

表3 HLA-B27 陽性人群不同疾病及性別分布

表4 疾病組及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型測(cè)序結(jié)果

圖2 疾病組及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型測(cè)序圖

3 討論

AS 是一種自身免疫性疾病，好發(fā)于青年男性，主要表現(xiàn)為骶髂關(guān)節(jié)和脊柱關(guān)節(jié)炎癥，致殘率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5-6]。發(fā)病率與種族相關(guān)，歐洲人群、亞洲人群、拉丁美洲人群分別為0.186%、0.180%和0.122%[3]，相對(duì)女性患者，男性的發(fā)病年齡較年輕，延誤診治的時(shí)間長(zhǎng)，脊柱的活動(dòng)度較差[5]。AS 的發(fā)病與多種因素有關(guān)，如蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、腸道細(xì)菌和肺炎克雷伯桿菌感染[7-11]。AS 的診斷主要依靠影像學(xué)和臨床表現(xiàn)，當(dāng)患者出現(xiàn)典型影像學(xué)改變和臨床表現(xiàn)時(shí)，常常已發(fā)展到中晚期，導(dǎo)致延誤診斷和治療。HLA-B27 是位于人體第6 號(hào)染色體短臂上的一個(gè)等位基因；由一條分子量為4.4×104的a 鏈和一條分子量為1.2×104的b 鏈組成[12]。HLA-B27 主要作用是參與特異性免疫應(yīng)答，在抵御外界病毒入侵時(shí)具有重大作用[13-14]。研究顯示AS 與HLA-B27 呈強(qiáng)關(guān)聯(lián)，AS 患者中約90%以上具有HLA-B27 抗原，健康對(duì)照人群只有7%左右[10，15-17]。HLA-B27 具有多種基因亞型，主要亞型為B2704、B2705，另有B2702、B2706、B2707、B2709 等；其中B2704、B2705 與AS 有高相關(guān)性[18-20]，而B2706、B2709 則被認(rèn)為是保護(hù)性的基因亞型[22]。

本研究南昌漢族人群AS 疾病陽性率為86.49%；明顯高于關(guān)節(jié)炎癥疾病患者11.02%（RA 和OA）、非關(guān)節(jié)炎癥型脊柱炎疾病患者6.93%（LIDH 和ST）疾病患者及健康體檢人群5.00%。以上數(shù)據(jù)顯示該地區(qū)HLA-B27基因在漢族AS 患者中具有較高的陽性率，與AS 的發(fā)病具有相關(guān)性，且是AS 的發(fā)病的高危因素之一。在臨床癥狀相似的疾病中，HLA-B27 抗原的檢測(cè)具有鑒別診斷的意義。該地區(qū)的AS 患者中HLA-B27 陽性率低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，提示該地區(qū)人群與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的人群具有種族差異性；HLA-B27基因具有不同的表現(xiàn)。其他非AS 的相似疾病組HLA-B27 陽性率與健康人群相比較無差異；而AS 疾病組中具有較高的陽性率，提示HLA-B27 抗原能夠用于鑒別診斷AS 及相關(guān)的自身免疫性疾病。30 ～＜40 歲組的男性人群的HLA-B27 抗原檢出率高于女性，AS 好發(fā)于青年且男性多見[21]，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

文獻(xiàn)報(bào)道韓國(guó)地區(qū)的AS 患者HLA-B27基因亞型主要為B2705（90.9%），而B2704（7.7%）[19]；土耳其地區(qū)AS 人群HLA-B27基因亞型主要為B2705（65.2%），而B2702（26.1%）[22]；在中國(guó)漢族AS 人群主要的基因亞型為B2704 與B2705，而歐洲白種人群主要基因亞型為B2705 及B2702。AS 組人群中B2704 亞型檢出率為75.0%（48/64），明顯高于其他疾病組人群；B2705 亞型的檢出率為21.8%（14/64），與非AS 疾病組和健康體檢人群的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明B2704 基因亞型是南昌地區(qū)漢族AS 患者的主要基因亞型，也是AS 易感基因亞型。本實(shí)驗(yàn)尚不能認(rèn)為基因亞型B2705 與AS 具有相關(guān)性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一致[22]。提示HLA-B27 具有種族差異性，不同地區(qū)人群的HLA-B27 主要基因亞型不同。其他疾病組及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型分析數(shù)據(jù)量少，單獨(dú)做統(tǒng)計(jì)分析意義不大；將其他疾病組與健康組合并后與AS 疾病進(jìn)行對(duì)比分析，得出B2709 基因亞型主要在非AS 疾病組及健康組人群中。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，南昌地區(qū)漢族人群AS 的發(fā)病主要為男性青年人群；且HLA-B27 陽性的人群患病率較HLA-B27 陰性的人群高。性別及HLA-B27基因亞型為AS 發(fā)病的危險(xiǎn)因素。HLA-B27抗原檢測(cè)及基因亞型分析可以作為該地區(qū)診斷AS 的輔助指標(biāo)，對(duì)于臨床表現(xiàn)可疑的男性青年患者，若發(fā)現(xiàn)B2704 的基因亞型，可以盡早采取有效的措施，早期干預(yù)疾病的發(fā)展，從而減低AS 疾病的致殘率，提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期限。因此，HLA-B27 亞型檢測(cè)對(duì)該地區(qū)的AS 治療和鑒別診斷具有重要意義。