劉潔，羅展雄，陳祖平

（柳州市人民醫(yī)院 心血管內科，廣西 柳州 545004）

心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命健康的主要原因之一，其中血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的基礎。內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，參與內皮組織損傷修復，其在骨髓、脾臟等多種器官中存在，內皮祖細胞可以遷移到外周血并聚集到損傷血管周圍促進損傷修復[1]。核轉錄因子核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的重要亞單位之一NF-κB p65，參與炎癥、細胞凋亡、細胞生長、氧化應激等過程，在腫瘤、心血管等疾病中扮演重要角色[2]。最近研究顯示，內皮祖細胞損傷與NF-кB p65 過度表達有關，在高糖、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,OX-LDL）等誘導的內皮祖細胞損傷中過度激活[3]。本實驗以人外周血內皮祖細胞為實驗對象，通過microRNA 干擾技術下調內皮祖細胞中NF-κB p65 的表達，探討其在OX-LDL 誘導的內皮祖細胞損傷中的作用，為明確動脈粥樣硬化發(fā)生機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康人外周血來自柳州市人民醫(yī)院。SYBR premix Ex Taq 和Prime Script RT reagent kit 購自大連TaKaRa 公司，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成，ECL 發(fā)光試劑盒、NF-кB p65 抗體均購自上海碧云天生物技術研究所，丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase,SOD）活力檢測試劑盒均購自北京Solarbio 公司，活化的Caspase-3 抗體、活化的Caspase-9 抗體均購自美國Abcam 公司，OX-LDL 購自美國Sigma 公司。

1.2 內皮祖細胞分離培養(yǎng)

取健康人外周血，按照密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，按照5×105個/cm2接種細胞種植到纖維連接蛋白包被好的24 孔細胞培養(yǎng)板中，每個孔中加入1 ml M199 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、b-FGF 1 和50 ng/ml 血管內皮生長因子（VEGF），放在飽和濕度、37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d 以后更換細胞培養(yǎng)液，添加PBS 洗滌后，貼壁細胞用免疫組織化學檢測CD34、VEGFR-2 的陽性表達率均＞90%，CD133 免疫熒光檢測其陽性率＞95%，DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙染染色陽性率＞90%，鑒定為內皮祖細胞[8]。

1.3 OX-LDL 處理后的內皮祖細胞中NF-κB p65表達水平

取內皮祖細胞，用0.25%胰蛋白酶將細胞配制成單細胞懸浮液，分別用0 和10 mg/L[1]OX-LDL 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 以后，記為Control 和OX-LDL，用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和Western blotting 檢測。

1.3.1 qRT-PCR取內皮祖細胞，用細胞總RNA 提取試劑盒分別提取內皮祖細胞的RNA，步驟按照試劑盒說明書標準流程操作。檢測其OD 260/280 nm 的比值在1.8 ～2.0。用Prime Script RT reagent kit 逆轉錄合成cDNA，用SYBR premix Ex Taq 分析NF-κB p65 mRNA 表達水平，反應條件設置為：95℃預變性10 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。GAPDH作 為參 照，2-△△Ct法分 析NF-κB p65 mRNA 水 平。GAPDH 引物正向：5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3'，反向：5'-GAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'。NF-κB p65 引物正向：5'-AAGATCAATGGCTCACAGG-3'，反向：5'-CCTCAATGTCTTCTTTCTGA-3'。

1.3.2 BCA 法蛋白定量取內皮祖細胞，用移液槍小心將上清吸棄以后，用PBS 將各組細胞洗滌2 次，分別在細胞中添加適量的裂解液，將細胞放在冰上裂解反應30 min，取細胞刮棒將各組細胞裂解液收集到離心管內，4℃高速離心以后，對蛋白進行定量，具體步驟同BCA 蛋白定量試劑盒操作流程。按照每個上樣泳道中添加樣品40 μg，濃縮膠90 V 電壓電泳，分離膠120 V 電壓電泳。在200 mA 電流條件下把凝膠上蛋白電轉至NC 膜后，用封閉液（5%牛血清白蛋白）將非特異性的位點封閉以后，同NF-κB p65 一抗（1∶200 稀釋）置于4℃過夜反應，與HRP 標記的二抗（1∶2 000 稀釋）結合2 h。按照增強化學發(fā)光法（ECL）發(fā)光，用Image J 軟件以GAPDH 作為參照分析NF-κB p65 蛋白表達。

1.4 慢病毒感染及細胞分組

內皮祖細胞分為4 組，分別為Control 組、OXLDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組，Control 組和OX-LDL 組處理方法同1.3 部分。siRNA control+OX-LDL 組為感染siRNA Control 陰性對照慢病毒的內皮祖細胞經(jīng)10 mg/L 的OX-LDL 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，NF-κB p65 siRNA+ OX-LDL 組為感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒的內皮祖細胞經(jīng)10 mg/L OX-LDL 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。慢病毒由山東維真生物科技有限公司構建，慢病毒感染方法簡述為：內皮祖細胞密度生長為60%時，將原細胞培養(yǎng)液吸棄，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，同時加入8 μg/ml 的聚凝胺，按照MOI 值為10 添加慢病毒顆粒，培養(yǎng)過夜以后，檢測GFP 熒光表達情況，感染效率高于90%。OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NFκB p65 siRNA+OX-LDL 組細胞用qRT-PCR 和Western blotting 檢測干擾效果，步驟同1.3 部分。

1.5 MTT 檢測細胞增殖

內皮祖細胞種植到96 孔培養(yǎng)板（提前用纖維連接蛋白包被）中，按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組處理培養(yǎng)。取出96 孔培養(yǎng)板，每孔加10 μl MTT，放在37℃靜置4 h。將孔內的液體分別吸除掉后，加DMSO將結晶溶解，將酶標儀調整到490 nm 波長處，檢測各孔的OD 值，用不添加細胞的孔調零以后，分析細胞存活率變化。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL分組培養(yǎng)后，添加1×PBS 將各組內皮祖細胞洗滌2 次。再加入0.25%胰蛋白酶將細胞收集后，加入400 μl 緩沖液混合，分別添加Annexin V-FITC 約10 μl 和PI 約5 μl 至各組待測細胞中混合，避光反應15 min。繼續(xù)加入100 μl 緩沖液，流式細胞儀檢測分析細胞凋亡水平。

1.7 Western blotting 檢測細胞中活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后，檢測細胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白表達情況，步驟同1.3部分中Western blotting 操作。

1.8 SOD 活力及MDA 含量檢測

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后，收集細胞，把細胞裂解以后，檢測裂解液中SOD 活力及MDA 含量，步驟均參照試劑盒說明書標準流程。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OX-LDL 誘導內皮祖細胞中NF-κB p65 的表達的影響

內皮祖細胞經(jīng)過OX-LDL 處理以后，細胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平均升高（P＜0.05）。OX-LDL 可以誘導內皮祖細胞中NF-κB p65 的表達。見表1 和圖1。

表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達的比較 （±s）

表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達的比較 （±s）

注：?與Control 組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65 mRNA NF-κB p65 蛋白Control 組 1.000±0.113 0.170±0.022 OX-LDL 組 1.852±0.121? 0.302±0.053?t值 12.269 4.181P值 0.000 0.000

圖1 OX-LDL 處理前后內皮祖細胞中NF-кB p65 表達

2.2 NF-κB p65 siRNA 對OX-LDL 條件下內皮祖細胞中NF-κB p65 表達的影響

內皮祖細胞感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒，經(jīng)過OX-LDL 處理以后，細胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平降低（P＜0.05）。見表2 和圖2。

2.3 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內皮祖細胞增殖活性的影響

OX-LDL 處理后內皮祖細胞存活率降低，細胞增殖能力下降（P＜0.05），敲低NF-κB p65 可以提高OX-LDL 條件下內皮祖細胞增殖活性。敲低NF-κB p65 具有拮抗OX-LDL 誘導的內皮祖細胞增殖抑制作用。見表3。

表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達的比較 （±s）

表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達的比較 （±s）

注：?與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

NF-κB p65 蛋白OX-LDL 組 1.000±0.000 0.279±0.016 siRNA control+OX-LDL 組 1.011±0.082 0.294±0.042 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 0.321±0.027? 0.110±0.031?F值 192.863 31.759P值 0.000 0.001組別 NF-κB p65 mRNA

圖2 NF-κB p65 siRNA 對OX-LDL 條件下 內皮祖細胞中NF-κB p65 沉默效果

2.4 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內皮祖細胞凋亡的影響

OX-LDL 處理后內皮祖細胞凋亡率升高，同時細胞中凋亡蛋白活化的Caspase-3、Caspase-9 水平也升高，敲低NF-кB p65 可以降低OX-LDL 條件下內皮祖細胞凋亡水平并下調細胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白水平（P＜0.05）。敲低NF-кB p65 具有拮抗OXLDL 誘導的內皮祖細胞凋亡作用。見圖3、4 和表4。

表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內皮祖細胞存活率 （%，±s）

表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內皮祖細胞存活率 （%，±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

組別 存活率Control 組 100.000±9.021 OX-LDL 組 58.449±8.1371）siRNA control+OX-LDL 組 60.479±7.232 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 81.359±8.6892）F組 23.709P組 0.000

2.5 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內皮祖細胞氧化損傷的影響

OX-LDL 處理后內皮祖細胞裂解液中抗氧化酶SOD 活性降低，MDA 含量升高，敲低NF-κB p65 能夠降低OX-LDL 條件下內皮祖細胞裂解液中MDA 含量，并提高SOD 活性（P＜0.05）。敲低NF-κB p65具有拮抗OX-LDL 誘導的內皮祖細胞氧化應激的作用。見表5。

圖3 內皮祖細胞凋亡

圖4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內皮祖細胞凋亡變化

表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內皮祖細胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 （±s）

表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內皮祖細胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 （±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

組別 凋亡率/% 活化的Caspase-3 活化的Caspase-9 Control 組 8.561±1.522 0.237±0.043 0.281±0.052 OX-LDL 組 28.957±3.7431） 0.410±0.0591） 0.542±0.0811）siRNA control+OX-LDL 組 29.411±4.171 0.417±0.033 0.560±0.072 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 15.782±1.1622） 0.320±0.0212） 0.393±0.0522）F值 36.044 13.215 12.877P值 0.000 0.002 0.002

表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內皮祖細胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 （±s）

表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內皮祖細胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 （±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

MDA 含量/（nmol/ml）組別 SOD 活性/（u/ml）Control 組 42.510±3.242 5.689±1.348 OX-LDL 組 9.892±1.1421） 14.581±1.7211）siRNA control+OX-LDL 組 10.210±1.262 14.821±1.958 NF-кB p65 siRNA+OX-LDL 組19.676±1.8722） 11.010±1.2312）F值 166.062 21.510P值 0.000 0.000

3 討論

近年來很多研究表明，在骨髓、臍帶血、外周血等中均有內皮祖細胞存在，內皮祖細胞作為血管內皮細胞的前體細胞，其以CD34、CD133、VEGFR-2 為標志，能夠分化成為內皮細胞，在血管新生及損傷修復中具有重要作用[4]。動脈粥樣硬化是以血管內皮損傷為主特征的心血管系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制與內皮祖細胞損傷密切相關[5]。OX-LDL 是動脈粥樣硬化發(fā)生的主要誘導因子，也是內皮功能障礙發(fā)生的原因之一，其可以誘導內皮祖細胞損傷[6]。本研究表明，OX-LDL組處理后的內皮祖細胞增殖活性降低，細胞凋亡增多，提示成功構建動脈粥樣硬化內皮祖細胞損傷模型。

NF-κB 在體內的分布極為廣泛，是一個轉錄因子家族，NF-κB 含有5 個成員，其中NF-κB p65 是重要的NF-κB 家族成員之一，其N 端含有Rel 同源區(qū)，參與DNA 結合和二聚體的形成，另外，NF-κB p65 還含有1 個TAD 結構域，具有正向調控基因轉錄的作用[7]。NF-κB p65 參與多種生理過程，包括細胞生長、凋亡、免疫反應等，在內皮細胞、心肌細胞等各種類型的細胞中均有表達[8]。目前研究表明，NF-κB p65 在動脈粥樣硬化中過度激活，參與內皮祖細胞損傷發(fā)生，在銀杏內酯B、Ang-1基因調控內皮祖細胞增殖中異常表達[9]。本實驗表明，OX-LDL 處理可以誘導內皮祖細胞中NF-κB p65 高表達，敲低其表達后可以減少OX-LDL 誘導的內皮祖細胞凋亡，提高內皮祖細胞增殖活性，提示敲低NF-κB p65 在動脈粥樣硬化內皮祖細胞損傷中發(fā)揮保護作用。

眾所周知，正常組織中細胞增殖和凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當細胞過度增殖或者過度凋亡時都可以引起疾病的發(fā)生，內皮祖細胞過度凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制之一[10]。細胞凋亡的發(fā)生與細胞內的Caspase 蛋白級聯(lián)反應有關，該級聯(lián)反應幾乎參與所有細胞的凋亡過程，Caspase-9 是位于凋亡反應上游的起始因子，Caspase-3 位于凋亡反應的下游，兩者在活化后可以促進細胞凋亡的發(fā)生。氧化應激是細胞凋亡發(fā)生的誘導因素之一，細胞內過量的氧自由基可以促進細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化，而細胞內過量的氧自由基與細胞內抗氧化酶SOD 活性降低有關，MDA是脂質發(fā)生過氧化的產(chǎn)物[11]。另外，內皮祖細胞氧化損傷也是動脈粥樣硬化發(fā)生的機制之一。NF-кBp65具有促進心肌細胞、血管內皮細胞等多種細胞凋亡作用，在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促進作用[12]。本實驗的研究結果顯示，OX-LDL 條件下，敲低NF-κB p65 后的內皮祖細胞中Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平降低，SOD 活性升高，MDA 含量降低，這可能表明敲低NFκB p65 通過降低OX-LDL 誘導的內皮祖細胞氧化應激減少細胞凋亡。

NF-κB p65 在內皮祖細胞損傷中表達水平升高，敲低其表達可以減少內皮祖細胞氧化應激和細胞凋亡，提高內皮祖細胞增殖活性，敲低NF-κB p65 表達具有減輕動脈粥樣硬化內皮祖細胞損傷作用，這為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機制提供了基礎，也為以后探討NF-κB p65 在內皮祖細胞損傷中的作用機制奠定了基礎，但對其具體的調控機制和作用機制尚不清楚，在以后的研究中將進一步探討。