陳玖紅，王 沛，王 平，胡 健，周青平

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

青藏高原地域遼闊，總面積約250萬km2，占中國陸地總面積的1/4。高寒草地面積約128萬km2，占青藏高原總面積的54%，是世界最大的天然草地區(qū)[1-2]。青藏高原山系平均海拔超過5 500 m，高海拔導(dǎo)致的相對低溫突出，是地球同緯度最寒冷的地區(qū)，也是全國的低溫中心之一。高原面上最冷月月均溫低至-15～-10 ℃，大部分地區(qū)最暖月月均溫 ＜ 10 ℃[2-3]。低溫會改變細胞膜透性[4]，通過氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)抑制植物代謝反應(yīng)[5-8]，造成植物在低溫環(huán)境下發(fā)育緩慢或不能正常生長。因此低溫是影響植物正常生長發(fā)育的關(guān)鍵因子之一。植物低溫脅迫分為冷害(0～20 ℃)和凍害(≤ 0 ℃)，且二者具有明顯差異，受到低溫傷害時質(zhì)膜會發(fā)生物相變化，由開始的液晶相轉(zhuǎn)為凝膠相，遭受凍害時造成細胞內(nèi)部結(jié)冰，破壞了原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)[9]。植物在不凍結(jié)的低溫下獲得更高的耐寒性的過程叫作冷適應(yīng)(又稱抗寒鍛煉)，經(jīng)過冷適應(yīng)植物的抗凍性也會有所提高，而植物的抗凍性則直接取決于抑制細胞內(nèi)冰晶形成的能力[10]。

披堿草屬(Elymus)是禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)一重要類群[11]，為青藏高原天然草地的建群種和優(yōu)勢種，主要分布在海拔2 000～5 200 m的地區(qū)，飼用價值高。該屬部分種具有抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐貧瘠、適應(yīng)性廣、遺傳多樣性豐富等優(yōu)良特性，是青藏高原地區(qū)的優(yōu)良草種[12]，且由于長期生長在高海拔地區(qū)其抗寒性最為突出。然而，因?qū)賰?nèi)不同種遺傳背景不同，以及不同種、不同野生種質(zhì)材料的生境不同，造成不同種及種質(zhì)之間抗寒性存在差異。本研究以來自高寒地區(qū)的3份垂穗披堿草(E.nutans)、2份老芒麥(Elymus sibiricus)、1份圓柱披堿草(E.breviaristatus)為試驗材料，通過比較冷脅迫下6份披堿草屬牧草幼苗膜脂過氧化程度、保護酶系統(tǒng)的活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化以及其相關(guān)關(guān)系，探討這6份披堿草屬牧草種質(zhì)材料幼苗的耐低溫生理特性，旨在為高寒地區(qū)的抗寒披堿草種質(zhì)篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試驗試劑

供試材料如表1所列，試驗采用盆栽法，以品氏營養(yǎng)土為培養(yǎng)介質(zhì)。2018年5月將6份材料的種子均勻撒播在花盆中，播種量為15 g·m-2，覆土，潤濕。材料放入人工氣候箱培養(yǎng)，每天日間光照為16 h，光照強度為12 300 lx，溫度為25 ℃，濕度為60%；夜間無光照，溫度為25 ℃，濕度為75%。待出苗后每隔2 d澆灌營養(yǎng)液(N∶P∶K = 1∶1∶1)一次，15 d后(株高約15 cm，生長至三葉期)進行冷脅迫處理：對照組溫度仍為25 ℃，處理組溫度為5 ℃，其他條件不變。冷脅迫8、16和24 d后進行相關(guān)指標的測定。每個處理設(shè)置6個重復(fù)。

1.2 測定項目及方法

每個處理隨機選取生長一致的幼苗，用蒸餾水沖洗干凈葉片，吸干水分。葉片相對含水量(ralative water content,RWC)和葉綠素(chlorophyll,Chl)含量的測定以《植物生理學(xué)實驗技術(shù)》為指導(dǎo)[13]。膜透性采用電導(dǎo)法測定[14]；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[15]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍四?(nitro-blue tetrazolium,NBT)法測定，過氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用紫外分光光度法測定[16]。

表1 6份供試牧草種質(zhì)材料來源Table 1 The sources of six Elymus germplasms

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用各指標的變化率(低溫處理下的測定值/對照下的測定值)消除各品種間的差異。當比值 ＜ 1 時，描述的是該指標與對照相比的降低情況；當比值 ＞1 時，表示的是該指標與對照相比的增加情況。本研究采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析，采用DUNCAN法對平均值進行多重比較，采用Origin 2017制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片相對質(zhì)膜透性變化率

冷脅迫下，相對質(zhì)膜透性變化率越低，對細胞膜的破壞程度越?。幌鄬|(zhì)膜透性變化率越高，對細胞膜的破壞越嚴重(圖1)。冷脅迫8 d時，I-1-1-1的相對質(zhì)膜透性變化率最高，細胞膜遭到的破壞最嚴重；12-9-1、11-6的相對膜透性變化率較低，細胞膜的破壞程度較小，且二者差異不顯著(P＞ 0.05)。冷脅迫16 d 時，I-1-5-66的相對膜透性變化率最高，細胞膜遭到的破壞最嚴重；12-9-1、09-214、11-6的相對膜透性變化率較低，細胞膜的破壞程度較小，且三者差異不顯著。冷脅迫24 d時，I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1相對膜透性變化率較高，細胞膜遭到的破壞較嚴重，且三者差異不顯著；12-9-1、09-214、11-6相對膜透性變化率較低，細胞膜的破壞程度較小，且三者差異不顯著。

圖1 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)葉片相對膜透性的變化率Figure 1 The difference between the changing rate of relative membrane permeability of six Elymus germplasms under chilling stress

相對質(zhì)膜透性變化率在冷脅迫8～16 d的過程中除I-1-5-66差異不顯著(P＞ 0.05)外，其他種質(zhì)材料差異均顯著(P＜ 0.05)；冷脅迫16～24 d時除I-1-5-66的相對質(zhì)膜透性變化率差異顯著外，其他種質(zhì)材料差異均不顯著。說明I-1-5-66前期的抗寒性較穩(wěn)定，隨著冷脅迫時間的延長，其抗寒性逐漸降低；12-9-1、I-1-1-10、I-1-1-1、09-214和 11-6在前期抗寒性顯著下降而后期變化不顯著，表現(xiàn)出了長期冷脅迫下對低溫的適應(yīng)能力。

2.2 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片丙二醛含量變化率

MDA含量變化率越低，膜脂過氧化程度越低；MDA含量變化率越高，膜脂過氧化程度越高(圖2)。冷脅迫8 d時，I-1-5-66的MDA含量變化率最高，膜脂過氧化程度最高；12-9-1、09-214、11-6的MDA含量變化率較低，膜脂過氧化程度較低，且三者差異不顯著(P＞ 0.05)。冷脅迫16 d 時，I-1-1-1的MDA含量變化率最高，膜脂過氧化程度最高；12-9-1的MDA含量變化率最低，膜脂過氧化程度最低。冷脅迫24 d 時，I-1-5-66、I-1-1-1的MDA含量變化率較高，膜脂過氧化程度較高，且二者差異不顯著；12-9-1、09-214、11-6的MDA含量變化率較低，膜脂過氧化程度較低，且三者差異不顯著。

圖2 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片丙二醛含量變化率Figure 2 The difference between the changing rate of the content of MDA for six Elymus germplasms under chilling stress

MDA含量變化率在冷脅迫8～16 d的過程中除I-1-1-1差異不顯著(P＞ 0.05)外，其他種質(zhì)材料差異均顯著 (P＜ 0.05)；冷脅迫 16～24 d時 I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1、11-6的MDA含量變化率差異顯著，12-9-1、09-214的差異均不顯著。說明I-1-1-1前期的抗寒性較穩(wěn)定，隨著冷脅迫時間的延長，其抗寒性顯著降低；12-9-1和09-214在前期抗寒性顯著下降而后期變化不顯著，表現(xiàn)出了長期冷脅迫下對低溫的適應(yīng)能力。

2.3 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片相對含水量變化率

RWC變化率越低，細胞的保水能力越弱；RWC變化率越高，細胞的保水能力越強(圖3)。冷脅迫8 d時，12-9-1、09-214、11-6的RWC變化率較高，細胞的保水能力較強，且三者差異不顯著(P＞0.05)；I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的RWC變化率較低，細胞的保水能力較弱，且三者差異不顯著。冷脅迫16 d、24 d時，12-9-1、09-214、11-6的RWC變化率較高，細胞的保水能力越較強，且三者差異不顯著；I-1-1-1的RWC變化率最低，細胞的保水能力最弱。

圖3 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片相對含水量變化率Figure 3 The difference between the changing rate of RWC for six Elymus germplasms under chilling stress

RWC變化率在冷脅迫8～16 d的過程中，I-1-1-10、I-1-1-1的 RWC 變化率顯著降低 (P＞ 0.05)，12-9-1、I-1-5-66、09-214、11-6 無顯著變化(P＜ 0.05)；冷脅迫16～24 d時，I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的RWC變化率顯著下降，12-9-1、09-214、11-6的RWC無顯著變化。說明I-1-1-10、I-1-1-1隨著冷脅迫時間的延長，抗寒性顯著減弱，對低溫敏感且適應(yīng)性較弱；12-9-1、09-214、11-6在長期冷脅迫下都能維持較強的抗寒性。

2.4 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片脯氨酸含量變化率

Pro含量變化率越低，對低溫的耐受能力越強；Pro含量變化率越高，對低溫的耐受能力越弱(圖4)。冷脅迫8 d時，I-1-5-66的Pro含量變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；12-9-1的Pro含量變化率最低，對低溫的耐受能力最強。冷脅迫16 d時，I-1-1-10的Pro含量變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；12-9-1、11-6的Pro含量變化率較低，對低溫的耐受能力較強，且二者差異不顯著(P＞0.05)。冷脅迫24 d 時，I-1-1-1的Pro含量變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；12-9-1、09-214、11-6的Pro含量變化率較低，對低溫的耐受能力較強，且三者差異不顯著。

圖4 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片脯氨酸含量變化率Figure 4 The difference between the changing rate of the content of Pro for six Elymus germplasms under chilling stress

Pro含量變化率在冷脅迫8～16 d的過程中，I-1-5-66、09-214、11-6的Pro含量變化率無顯著差異(P＞ 0.05)外，其他種質(zhì)材料的Pro含量變化率均顯著升高 (P＜ 0.05)；冷脅迫 16～24 d時除 09-214的Pro含量變化率無顯著變化外，其余種質(zhì)材料均有顯著變化。說明I-1-5-66前期的抗寒性較穩(wěn)定，隨著冷脅迫時間的延長，其抗寒性顯著降低；09-214在長期冷脅迫的環(huán)境下能夠維持較穩(wěn)定的抗寒性，對低溫不敏感。

2.5 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片可溶性糖含量變化率

SS含量變化率越低，對低溫的耐受能力越強；SS含量變化率越高，對低溫的耐受能力越弱(圖5)。冷脅迫8 d時，I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的SS含量變化率較高，對低溫的耐受能力較弱，且三者差異不顯著(P＞ 0.05)；09-214的SS含量變化率最低，對低溫的耐受能力最強；冷脅迫16 d 時，I-1-5-66的SS含量變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；12-9-1的SS含量變化率最低，對低溫的耐受能力最強。冷脅迫24 d 時，I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的SS含量變化率較高，對低溫的耐受能力較弱，且三者差異不顯著；11-6的SS含量變化率最低，對低溫的耐受能力最強。

圖5 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片可溶性糖含量變化率Figure 5 The difference between the changing rate of the content of SS for the six Elymus germplasms under chilling stress

SS含量變化率在冷脅迫8～16 d的過程中，除11-6無顯著變化外(P＞ 0.05)，其他種質(zhì)材料均呈顯著變化 (P＜ 0.05)；冷脅迫 16～24 d 時，I-1-1-1、09-214、11-6的SS含量變化率無顯著變化，其余種質(zhì)材料均有顯著變化。說明I-1-1-1、09-214的SS含量變化率在冷脅迫前期顯著升高，但隨冷脅迫時間的延長，SS含量變化率無顯著變化，對長期冷脅迫的環(huán)境有一定的適應(yīng)性；11-6在長期冷脅迫的環(huán)境下能夠維持較穩(wěn)定的抗寒性，對低溫不敏感。

2.6 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)葉片的葉綠素含量變化率

Chl含量變化率越高，對低溫的耐受能力越強；Chl含量變化率越低，對低溫的耐受能力越弱(圖6)。冷脅迫8 d時12-9-1的Chl含量變化率最高，抗寒性最強；I-1-5-66的Chl含量變化率最低，對低溫的耐受能力最弱。冷脅迫16 d 時，09-214的Chl含量變化率最高，對低溫的耐受能力最強；I-1-5-66、I-1-1-1的Chl含量變化率較低，對低溫的耐受能力較弱，且二者差異不顯著(P＞ 0.05)。冷脅迫24 d 時，11-6的Chl含量變化率最高，對低溫的耐受能力最強；I-1-1-1的Chl含量變化率最低，對低溫的耐受能力最弱。

圖6 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)的葉片葉綠素含量變化率Figure 6 The difference between the changing rate of the content of Chl for six Elymus germplasms under chilling stress

Chl含量變化率在冷脅迫8～16 d的過程中，除I-1-5-66、09-214無顯著變化外 (P＞ 0.05)，其他種質(zhì)材料均呈現(xiàn)顯著變化(P＜ 0.05)；冷脅迫16～24 d的過程中，所有種質(zhì)材料的Chl含量變化率均有顯著差異。說明所有供試材料隨著冷脅迫時間的延長，抗寒性出現(xiàn)顯著變化。

2.7 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)葉片的超氧化物歧化酶活性變化率

SOD活性變化率越高，對低溫的耐受能力越弱；SOD活性變化率越低，對低溫的耐受能力越強(表2)。冷脅迫8 d時，I-1-1-10的SOD活性變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；09-214、11-6的SOD活性變化率較低，對低溫的耐受能力較強，且二者差異不顯著(P＞ 0.05)。冷脅迫16 d 時，I-1-1-1的SOD活性變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；09-214的SOD活性變化率最低，對低溫的耐受能力最強。冷脅迫24 d 時，I-1-1-10的SOD活性變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；I-1-1-1的SOD活性變化率最低，對低溫的耐受能力最強。

表2 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)超氧化物歧化酶活性的變化率Table 2 The difference between rate of change of SOD activity for the six Elymus germplasms under chilling stress%

SOD活性變化率在冷脅迫8～16 d的過程中除09-214變化不顯著(P＞ 0.05)外，其余種子均出現(xiàn)顯著變化(P＜ 0.05)；16～24 d時除11-6變化不顯著外，其余種質(zhì)材料均表現(xiàn)出顯著變化。

2.8 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)葉片的過氧化物酶活性變化率

CAT活性變化率越高，對低溫的耐受能力越弱；CAT活性變化率越低，對低溫的耐受能力越強 (表3)。冷脅迫 8 d時 12-9-1和 I-1-5-66的 CAT活性變化率較高，對低溫的耐受能力較弱，且二者差異不顯著(P＞ 0.05)；I-1-1-10的CAT活性變化率最低，對低溫的耐受能力最強。冷脅迫16 d 時，I-1-5-66的CAT活性變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；I-1-1-10的CAT活性變化率最低，對低溫的耐受能力最強。冷脅迫24 d 時，I-1-5-66的CAT活性變化率最高，對低溫的耐受能力最弱；12-9-1和11-6的CAT活性變化率最低，對低溫的耐受能力最強。

表3 冷脅迫下6份披堿草屬種質(zhì)葉片過氧化物酶活性的變化率Table 3 The difference between rate of change of CAT activity for the six Elymus germplasms under chilling stress%

CAT活性變化率在8～16 d時除I-1-1-10、I-1-1-1變化不顯著外(P＞ 0.05)，其余種質(zhì)材料的變化均顯著(P＜ 0.05)；在16～24 d過程中，除12-9-1變化不顯著外，其余種質(zhì)材料的變化均顯著。

2.9 6份披堿草屬種質(zhì)苗期抗寒性的綜合評價

分別在冷脅迫8、16和24 d時對6份披堿草種質(zhì)材料各指標變化率的均值進行隸屬函數(shù)評價，以衡量其苗期抗寒性(表4)。結(jié)果表明，12-9-1、11-6、09-214對低溫的抵抗能力較強，而I-1-1-10、I-1-5-66、I-1-1-1對低溫的抵抗能力較弱。

表4 6份披堿草屬種質(zhì)苗期抗寒性隸屬函數(shù)值評價Table 4 Evaluation of membership function values of six Elymus germplasms at seeding stage of chilling resistance

3 討論

RWC、相對質(zhì)膜透性、MDA含量、Chl含量是鑒定植物在冷脅迫環(huán)境下的組織代謝活動和抗寒性的重要指標[17]。在本研究中，長期(24 d)冷脅迫環(huán)境下，12-9-1、09-214、11-6能維持較高的RWC變化率、相對質(zhì)膜透性變化率、MDA含量變化率、Chl含量變化率，但I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的RWC變化率、相對質(zhì)膜透性變化率、MDA含量變化率、Chl含量變化率較低。說明處于高海拔地區(qū)(＞ 2 900 m)的 12-9-1、09-214、11-6 始終能夠維持較強的抗寒性，低海拔地區(qū)(＜ 1 900 m)的I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1的抗寒性較弱。且冷脅迫8～16 d的過程中，12-9-1、09-214和11-6的相對質(zhì)膜透性變化率和MDA含量變化率都顯著下降，而其他種質(zhì)材料下降不顯著。植物可以通過降低相對質(zhì)膜透性和MDA含量，降低對細胞膜的破壞程度，提高植物的抗寒性。12-9-1、09-214、11-6的細胞膜破壞程度顯著降低，說明高海拔地區(qū)(＞ 2 900 m)的12-9-1、09-214和11-6對低溫的適應(yīng)能力較快。綜上所述，高海拔的12-9-1、09-214和11-6表現(xiàn)出較強抗寒性和低溫適應(yīng)性，與付娟娟等[6]的研究結(jié)果相同。

細胞膜系統(tǒng)是感受冷脅迫最敏感的部位[18]，相對質(zhì)膜透性和丙二醛含量作為直接衡量細胞膜破損程度的兩個指標，在短期冷脅迫(8 d)下，所有供試材料的相對質(zhì)膜透性和丙二醛含量在短期冷脅迫后迅速增加，為對照的2～4倍；相對含水量變化率為對照的0.7～0.95倍，表明供試種質(zhì)材料在冷脅迫下細胞的保水能力下降，且12-9-1、09-214和11-6的保水能力高于I-1-5-66、I-1-1-10和I-1-1-1；冷脅迫8 d后，葉綠素含量為對照的0.4～0.8倍。有研究表明，葉綠素含量是隨低溫脅迫的加劇而呈現(xiàn)下降趨勢的[19]，但也有研究表明[20]隨低溫脅迫的加劇葉綠素含量呈上升趨勢。原因是前者在試驗過程中并不是逐步降低溫度，可能導(dǎo)致葉綠素的破壞，與本研究的結(jié)果相似；后者是逐步降低溫度且各處理僅有8 h，僅是模擬了一個低溫脅迫環(huán)境，短期的低溫脅迫無法使葉綠素部分光合機構(gòu)失活，葉綠素的破壞需要一個長期的過程。

許多研究主張采用Pro含量和SOD、POD、CAT活性評價植物的脅迫抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，Pro含量、SS含量、SOD活性和CAT活性的變化率與抗寒性的關(guān)系復(fù)雜，不宜作為隸屬函數(shù)的評價指標。

有研究表明：Pro含量變化的原因無法確定，也許是由于蛋白質(zhì)合成受阻或蛋白質(zhì)降解[21]，且植物體內(nèi)Pro和可溶性蛋白質(zhì)的含量并非簡單的互相消長的關(guān)系[20]；也許是由于其本身合成受激或氧化受阻[22]。且Pro含量的變化與冷脅迫的程度和時間也有關(guān)系，當超過植物自身滲透調(diào)節(jié)能力極限時，植物的滲透調(diào)節(jié)就會失效。在無嚴重冷害時，Pro的積累則是一種適應(yīng)性反應(yīng)[20]。同樣作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的SS與Pro具有相似性[23]。

另外，SOD作為保護酶體系中的關(guān)鍵酶，也是第一活性氧自由基造成的氧化損傷的第一道防線，與自由基反應(yīng)生成H2O2，而CAT則是專一清除H2O2的酶[24]。過去的諸多研究對SOD和CAT活性與植物抗寒性的關(guān)系結(jié)果不一，既有研究表明二者活性越高抗寒性越強[8]，也有研究表明其活性越高抗寒性越弱[20]。且在不同溫度下SOD活性的變化規(guī)律也不同，SOD活性隨溫度降低而逐漸增高，但在到達臨界溫度時迅速下降，不同材料的臨界溫度不同[25]。有研究表明[26]，植物遭受冷脅迫時，酶促反應(yīng)受到膜系統(tǒng)破壞的影響，造成反應(yīng)的順序和方向性錯誤。

綜上所述，不宜直接采用Pro、SS含量變化率及SOD、CAT活性的變化率的隸屬函數(shù)值進行抗寒性評價，具體冷脅迫下它們的響應(yīng)機制還需進一步研究討論。本研究隸屬函數(shù)評價結(jié)果表明，Pro、SS含量變化率及SOD、CAT活性變化率越小其抗寒能力越強，這與夏鐵騎[27]的研究結(jié)果相同。

4 小結(jié)

高海拔地區(qū)(＞ 2 900 m)的12-9-1、09-214、11-6通過保持冷脅迫下低的相對質(zhì)膜透性和高的滲透調(diào)節(jié)能力以維持細胞內(nèi)水分和葉綠素含量，表現(xiàn)出更強的對寒冷的抵抗能力，其抗寒性強于低海拔 (＜ 1 900 m)對寒冷較敏感的 I-1-5-66、I-1-1-10、I-1-1-1。在長期低溫脅迫過程中，雖然所有供試材料都表現(xiàn)出對低溫的適應(yīng)能力，但高海拔地區(qū)的12-9-1、09-214、11-6對低溫的適應(yīng)能力較強。