謝易 魏杰 龔泰芳

（十堰市太和醫(yī)院骨科，湖北十堰442000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種典型的與年齡相關(guān)的疾病，最常見于老年人[1]。其臨床特征主要包括關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、腫脹及畸形，導(dǎo)致患者運(yùn)動受限，嚴(yán)重危害老年人健康[2]。目前關(guān)于OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究顯示軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少以及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解引起軟骨退變，是導(dǎo)致OA的潛在機(jī)制之一[3，4]。有研究指出，OA的嚴(yán)重程度與軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量密切相關(guān)[5]，有效減少軟骨細(xì)胞的凋亡對于OA的治療和預(yù)防尤為重要。MicroRNA（miRNA）通過其靶基因 mRNA 3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′-UTR）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生理過程[6]。研究顯示miRNA參與維持軟骨發(fā)育過程中的穩(wěn)態(tài)及OA發(fā)病過程[7]。文獻(xiàn)報道m(xù)iR-105在OA患者來源的病理細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在正常細(xì)胞中高表達(dá)[8]。目前研究顯示miR-105常見于各種癌癥，并發(fā)揮抑癌作用[9，10]，而在OA中的研究尚在探索中。miR-105是否參與OA的發(fā)病尚不清楚。因此，研究miR-105對從OA軟骨中分離的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響十分必要。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)UTs）是一種生物合成酶，參與機(jī)體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織發(fā)育、炎癥、癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等多種生物過程[11]。有證據(jù)表明，F(xiàn)UTs控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[12]。有文獻(xiàn)稱FUT4在OA病理細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)較為顯著的高表達(dá)[13]，推測FUT4可能參與OA病理過程。本研究研究miR-105通過靶向結(jié)合FUT4對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，以期為治療OA提供新的作用靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無菌OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織樣品（取自全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者，符合中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會OA診斷標(biāo)準(zhǔn)）和正常關(guān)節(jié)軟骨組織樣品（取自無OA或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的股骨、頸骨骨折全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者）置液氮中冷凍，-80℃儲存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所取樣本的患者及家屬均簽署了知情同意書。

DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國Hyclone公司提供）；青霉素鈉和慶大霉素（上海生工工程有限公司提供）；胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司提供）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）和Trizol提取試劑（美國Invitrogen公司提供）；MTT、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa公司提供）；miR-105模擬物、miR-105模擬物對照、miR-105抑制劑、miR-105抑制劑對照及空質(zhì)粒（廣州銳博生物科技有限公司提供）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒（大連寶生物工程有限公司提供）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司提供）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）、ECL化學(xué)發(fā)光液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所提供）；SDS-PAGE（本實(shí)驗(yàn)室配制）；FUT4小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和siRNA對照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供）；FUT4互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）過表達(dá)載體（北京傲銳東源生物科技有限公司提供，有效性已由公司驗(yàn)證）；FUT4抗體及二抗（美國Abcam公司提供）；實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)

參照唐新等[14]所述方法分離原代人軟骨細(xì)胞，除去多余的結(jié)締組織，切成約1 mm3切塊，用含雙抗（青霉素鈉和慶大霉素）的PBS清洗數(shù)次，加入0.1%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，然后用0.2%Ⅱ型膠原酶消化16 h，期間每5 h收集1次細(xì)胞。使用200目濾網(wǎng)進(jìn)行分離，收集細(xì)胞以1000 rpm離心5 min，去上清，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌并重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以1×105/ml密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于含有5%CO2飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Real-time PCR檢測

采用Trizol法提取軟骨細(xì)胞總RNA，采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)SYBR Premix Ex Tap試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參計算miR-105相對表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參計算FUT4相對表達(dá)水平，采用相對定量2-△△CT法計算細(xì)胞中miR-105和FUT4的相對表達(dá)水平。各引物的引物序列詳見表1。

表1 各引物的引物序列

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）檢測

收集軟骨細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，取等量蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離蛋白后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入FUT4一抗（1∶1000稀釋），在4℃條件下孵育過夜，再加入二抗（1∶1500稀釋），室溫孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光（electro chemi luminescence，ECL）液進(jìn)行顯影，在掃描儀中成像，以GAPDH灰度值為參照，分析FUT4蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將生長狀態(tài)良好的OA軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染miR-105模擬物的細(xì)胞記為miR-105 mimic組，轉(zhuǎn)染miR-105模擬物對照的細(xì)胞記為NC-mimic組；轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor組，轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑對照的細(xì)胞記為NC inhibitor組；轉(zhuǎn)染FUT4 cDNA過表達(dá)載體的細(xì)胞記為pc-FUT4組，轉(zhuǎn)染FUT4 cDNA過表達(dá)載體對照的細(xì)胞記為pc-NC組；轉(zhuǎn)染FUT4 siRNA的細(xì)胞記為si-FUT4組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞記為si-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA對照的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA對照的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-NC組。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

使用數(shù)據(jù)庫TargetScan進(jìn)行預(yù)測分析miR-105靶基因結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-105和FUT4 3′-UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增miR-105和FUT4 3′-UTR結(jié)合片段及突變序列，分別構(gòu)建包含分別構(gòu)建包含miR-105結(jié)合位點(diǎn)的FUT4 3′-UTR野生型質(zhì)粒（FUT4 WT）和突變型質(zhì)粒（FUT4 MUT）。取對數(shù)生長期的OA軟骨細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為4×103/孔，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。共轉(zhuǎn)染FUT4 WT與miR-105模擬物的細(xì)胞記為FUT4 WT+miR-105 mimic組，共轉(zhuǎn)染FUT4 WT與miR-105模擬物對照的細(xì)胞記為FUT4 WT+NC mimic組；共轉(zhuǎn)染FUT4 MUT與miR-105模擬物的細(xì)胞記為FUT4 MUT+miR-105 mimic組，共轉(zhuǎn)染FUT4 MUT與miR-105模擬物對照的細(xì)胞記為FUT4 MUT+NC mimic組。轉(zhuǎn)染24 h后，參照熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測螢火蟲熒光素酶熒光強(qiáng)度及海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度，兩者的比值表示熒光素酶相對活性。

1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染1～5 d后各組OA軟骨細(xì)胞分別通過MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，在每孔細(xì)胞中加入50 μl MTT溶液，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔細(xì)胞中再加入200 μl DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm處測定每組細(xì)胞光密度值，以表示各組細(xì)胞增殖能力。

1.8 Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染后48 h的各組OA軟骨細(xì)胞，以胰蛋白酶消化，PBS清洗，離心收集細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞中依次加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測，使用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以單因素方差分析比較多組間差異，以SNK-q檢驗(yàn)比較兩兩組間差異，每組數(shù)據(jù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取均值，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-105和FUT4在OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況

為研究miR-105和FUT4在OA軟骨細(xì)胞中的作用，通過Real-time PCR檢測人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105和FUT4的表達(dá)水平，與正常軟骨細(xì)胞相比較，OA軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著升高（圖1A），F(xiàn)UT4 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下降（圖1B、C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示miR-105和FUT4的在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖1D）。

圖1 人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105和FUT4的表達(dá)水平

2.2 上調(diào)或下調(diào)miR-105對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為研究miR-105對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，分別將miR-105模擬物及miR-105抑制劑轉(zhuǎn)染到OA軟骨細(xì)胞中，經(jīng)Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-105的表達(dá)量顯示轉(zhuǎn)染miR-105模擬物后細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著升高，轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑后細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著降低，與各自對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2A），提示轉(zhuǎn)染miR-105模擬物或miR-105抑制劑能夠上調(diào)或下調(diào)miR-105的表達(dá)。MTT法和Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示與NC mimic組比較，miR-105 mimic組細(xì)胞增殖能力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2B、C）；與NC inhibitor組比較，miR-105 inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2B、C），提示miR-105對OA軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用。

圖2 轉(zhuǎn)染后對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 FUT4是miR-105的靶基因

在線數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)UT4 mRNA的3′UTR與miR-105核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-105模擬物可顯著降低含有FUT4 mRNA的3′UTR結(jié)合序列細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.05），而對含有FUT4 mRNA的3′UTR突變序列細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05）（圖3B），表明miR-105可與FUT4 mRNA的3′UTR結(jié)合，提示FUT4是miR-105的靶基因。

2.4 miR-105靶向調(diào)控FUT4

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-105與FUT4的靶向關(guān)系，本研究構(gòu)建了共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA以及共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA的OA軟骨細(xì)胞，檢測對FUT4表達(dá)的影響，與miR組相比較，miR+FUT4 cDNA組細(xì)胞中FUT4的表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A）；與anti-miR組相比較，anti-miR+FUT4 siRNA組細(xì)胞中FUT4的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。通過共轉(zhuǎn)染能夠回調(diào)由上調(diào)或下調(diào)miR-105對FUT4表達(dá)的影響。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-105能夠負(fù)向調(diào)控FUT4的表達(dá)。

2.5 miR-105通過靶向調(diào)控FUT4影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡

通過MTT法和Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測共轉(zhuǎn)染的OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果顯示，與miR-105 mimic+pc-NC組相比，miR-105 mimic+pc-FUT4組細(xì)胞增殖能力升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5A、B），表明過表達(dá)FUT4部分逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-105表達(dá)對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響；與miR-105 inhibitor+si-NC組相比，miR-105 inhibitor+si-FUT4組細(xì)胞增殖能力升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5C、D），表明下調(diào)FUT4部分逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-105表達(dá)對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。提示miR-105能夠通過負(fù)向調(diào)控FUT4表達(dá)影響人OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。

圖3 miR-105與FUT4 mRNA的3’UTR靶向結(jié)合

圖4 miR-105靶向調(diào)控FUT4的表達(dá)

圖5 共轉(zhuǎn)染對人OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

OA是一種以軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯穆酝诵行怨顷P(guān)節(jié)疾病，病情嚴(yán)重時可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙[15，16]。OA的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，近年來的研究報道m(xù)iRNA與該疾病的發(fā)病密切相關(guān)，參與OA的炎性反應(yīng)等多項(xiàng)進(jìn)程[17-19]，如miR-15a通過抑制其靶基因的表達(dá)誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，參與OA的進(jìn)展[20]。目前研究表明，miR-105能夠顯著抑制胃癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌等癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[21-25]。然而，miR-105在OA中的研究仍較少。本研究通過Real-time PCR檢測人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量，顯示miR-105在人OA軟骨細(xì)胞中呈低表達(dá)，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染上調(diào)OA軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞的增殖能力升高，細(xì)胞凋亡率降低。與Ji等[8]的研究結(jié)果類似，miR-105在OA患者中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)GF2/miR-105在OA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。上述結(jié)果說明miR-105對OA軟骨細(xì)胞起保護(hù)作用。

FUTs家族是一組巖藻糖基化合酶。目前認(rèn)為人血清中一些FUTs活性升高，可作為惡性腫瘤的指征，F(xiàn)UTs活性與疾病發(fā)展過程（如炎癥）關(guān)系密切[26-29]。目前多項(xiàng)研究表明FUTs家族可能在某些關(guān)節(jié)炎中起重要作用，但FUTs對OA影響的研究仍較少。本研究分析了人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中FUT4基因和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細(xì)胞中FUT4 mRNA和蛋白水平顯著增加。因此，有必要進(jìn)一步研究闡明FUT4在OA中的作用機(jī)制。本研究通過生物信息學(xué)工具預(yù)測并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)UT4是miR-105的直接靶基因，且FUT4表達(dá)受軟骨細(xì)胞中內(nèi)源性miR-105的調(diào)節(jié)。此外，miR-105的過表達(dá)顯著促進(jìn)了OA軟骨細(xì)胞的生長并抑制細(xì)胞凋亡，而這種效應(yīng)可以通過與FUT4 cDNA的共轉(zhuǎn)染來逆轉(zhuǎn)。FUT4的敲除逆轉(zhuǎn)了miR-105的敲除導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞凋亡抑制作用。這與Isozaki等[30]的報道類似，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞裂解物中α(1，2)-連接的巖藻糖基化蛋白顯著高于正常滑膜成纖維細(xì)胞裂解物。Benedetti等[31]關(guān)于青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的研究發(fā)現(xiàn)，與患者外周血T細(xì)胞相比，滑液中FUT7 mRNA水平上調(diào)。

本研究首先檢測了miR-105和FUT4基因在人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FUT4在OA軟骨細(xì)胞中異常上調(diào)。通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了FUT4是miR-105的直接靶基因，并鑒定了miR-105在OA中通過負(fù)向調(diào)控FUT4影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。因此，miR-105-FUT4信號軸可作為OA治療中的潛在治療靶點(diǎn)。