徐珠錦 劉 軍 謝文熙 陳 傳 郭 震

廣東醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實驗室,廣東省湛江市 524023

不同細菌的芽孢形態(tài)和位置有較大差異，因此直接觀察細菌的芽孢可作鑒定細菌的方法之一[1]。破傷風(fēng)梭菌玻片標本是微生物實驗教學(xué)不可缺少的標本，學(xué)生可通過破傷風(fēng)梭菌玻片標本掌握芽孢形態(tài)結(jié)構(gòu)和加深已學(xué)知識的理解。以往，我們傳統(tǒng)制作破傷風(fēng)梭菌玻片標本的方法主要有皰肉湯培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基取菌液涂片方法，可是這兩種方法制作的標本鏡下觀察不清晰或芽孢量少。我們在長期的醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗準備過程中發(fā)現(xiàn)，通過用血清葡萄糖培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法培養(yǎng)破傷風(fēng)梭菌制作的玻片標本，可以克服上述不足。同時又能制成長期保存的染色標本，以滿足教學(xué)的需要，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌種 為本實驗室保存的破傷風(fēng)梭菌ATCC19406。

1.2 20%血清葡萄糖培養(yǎng)基的制備 取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.3g加入蒸餾水100ml混勻溶解，高壓滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至55～60℃時加入無菌20%葡萄糖20ml和無菌兔血清25ml混合輕輕搖晃均勻，傾注在15cm×10cm無菌平板上，冷卻凝固后放置冰箱備用。

1.3 染色液的配制 結(jié)晶紫染液：稱取結(jié)晶紫8g，溶于100ml 95%乙醇中制成飽和液。取20ml飽和液于80ml 10g/L草酸銨溶液混合即成，過濾后備用。結(jié)晶紫購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，95%乙醇購于廣州友聯(lián)化學(xué)試劑廠。盧戈碘液：先將2g碘化鉀溶于10ml蒸餾水中，再加1g碘，待碘全部溶解后加300ml蒸餾水。碘化鉀和碘購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司[2]。

1.4 破傷風(fēng)梭菌芽孢玻片標本的制作 傳統(tǒng)的方法為將破傷風(fēng)梭菌ATCC19406種于皰肉湯培養(yǎng)基中，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液2ml經(jīng)2 000r/min離心，沉渣重復(fù)洗絳2次，用接種環(huán)取菌液2環(huán)輕輕放置于載玻片上，放室溫自然干燥，火焰加溫固定。用孔雀綠水胞染色法進行芽孢染色[2-4]。

改進的方法為先按常規(guī)將分離后純種的破傷風(fēng)梭菌種在血清葡萄糖培養(yǎng)基平板上，放置于裝有2小包厭氧產(chǎn)包的圓底立式厭氧培養(yǎng)袋中37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h， 隨后在無菌空平皿中放5ml無菌生理鹽水，首先在無鹽水的地方用接種環(huán)刮取破傷風(fēng)梭菌平板的菌苔于空平板上研磨，然后與鹽水混勻。菌液放置5min后，取上清液涂片。放室溫自然干燥，火焰加溫固定。先用結(jié)晶紫溶液染1min，流水沖洗，用盧戈碘液媒染1min，流水沖洗，95%酒精脫水20s。染色待其自然干燥，2周后用中性樹膠蓋上蓋玻片封片。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星有限公司。2.5L圓底立式培養(yǎng)袋購自青島海博生物技術(shù)有限公司。日本三菱MGC厭氧產(chǎn)包購自三菱瓦斯化學(xué)株會社。載玻片購于鹽城匯達醫(yī)療機械有限公司。蓋玻片鹽城匯達醫(yī)療機械有限公司。中性樹膠購自中國上海標本模型廠。

2 結(jié)果

圖1顯示，傳統(tǒng)方法制得的標本背景臟，芽孢結(jié)構(gòu)不清晰，在一個視野里細菌芽孢極少。圖2顯示，改進方法制得的標本背景清潔，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整清晰，在一個視野里幾乎所有細菌都有芽孢形成。經(jīng)過染色后芽孢內(nèi)部為無色空泡，呈典型鼓槌狀。

圖1 傳統(tǒng)方法的破傷風(fēng)梭菌芽孢

圖2 改良方法的破傷風(fēng)梭菌芽孢

3 討論

傳統(tǒng)方法的破傷風(fēng)梭菌芽孢之所以明顯少于改良方法，分析原因可能如下：(1)皰肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂平板雖然營養(yǎng)成分均不是非常豐富，但相對于皰肉湯培養(yǎng)基來說營養(yǎng)成分過低，因此影響破傷風(fēng)梭菌芽孢的繁殖生長。(2)破傷風(fēng)梭菌屬于嚴格厭氧的腐物寄生菌，芽孢是在細菌繁殖不利的條件才形成，是細菌抵抗不良環(huán)境的反應(yīng)[5]。血清葡萄糖培養(yǎng)基平板因為缺乏C、N、P元素也可導(dǎo)致芽孢生成基因高表達從而使破傷風(fēng)梭菌的芽孢形成增多[6]。(3)厭氧環(huán)境不同：破傷風(fēng)梭菌為嚴格厭氧菌，必須在完全無氧的環(huán)境下培養(yǎng)才產(chǎn)生芽孢。傳統(tǒng)的皰肉湯培養(yǎng)基是利用皰肉消耗液體中的氧氣，使培養(yǎng)基達到缺氧環(huán)境，但皰肉消耗液體中的氧氣非常有限，根本無法達到完全消耗液體中的氧氣，而厭氧產(chǎn)氣袋方法培養(yǎng)，操作方便簡單，可通過化學(xué)反應(yīng)完全消除厭氧袋中的氧氣，造成厭氧效果更加明顯。(4)傳統(tǒng)的孔雀綠水芽孢染色法，染色時間長，操作繁瑣，芽孢著色淺，對比不明顯[7]，而結(jié)晶紫可使菌體和芽孢外膜著上紫色，但芽孢對水溶性染料的滲透能力差，芽孢不著色，加之折光系數(shù)高，從而導(dǎo)致外膜及菌體輪廓格外清晰，隨后95%酒精短時間脫色使視野背景更加清潔[8]。

值得注意的是，采用制備血清葡萄糖培養(yǎng)基要注意加樣的順序，正確的加樣順序應(yīng)是：第一步取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.3g加入蒸餾水100ml混勻溶解后高壓滅菌，第二步是等上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻在55～60℃時取已準備好滅菌的20%葡萄糖20ml加入培養(yǎng)基中混均，第三步將滅活兔血清25ml加入培養(yǎng)基中混合均勻，這因為兔血清較黏稠難混合均勻，先加葡萄糖容易混合均勻，既可以降低培養(yǎng)基溫度，又達到不破壞兔血清營養(yǎng)成分，同時又可避免營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固過快，這樣才能保證所配制的培養(yǎng)基混合均勻，取菌液染色時背影干凈。

綜上所述，改進方法制備的教學(xué)標本片，在一張標本片上可以看到破傷風(fēng)梭菌的形態(tài)和芽孢結(jié)構(gòu)，以及染色后呈革蘭陽性菌，便于學(xué)生觀察和理解。