劉丹梅 李文利 王丹丹

摘要：采用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）的方法，在DNA分子水平上對我國不同地區(qū)、不同化性的71個柞蠶品種進(jìn)行聚類分析。從140條RAPD隨機(jī)引物中篩選出28條可穩(wěn)定擴(kuò)增條帶的多態(tài)性引物，共擴(kuò)增出92條多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的29%;采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）聚類法對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建了71個柞蠶品種的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示，各個地區(qū)與不同化性的柞蠶品種之間親緣關(guān)系沒有明顯區(qū)別，遺傳類型相互混雜。

關(guān)鍵詞：RAPD標(biāo)記;柞蠶;UPGMA;聚類分析;親緣關(guān)系

中圖分類號： S885.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0061-05

柞蠶屬于鱗翅目（Lepidoptera）天蠶蛾科（Saturniidae）的絹絲類昆蟲，我國境內(nèi)的柞蠶在分類學(xué)上屬于柞蠶（Antheraea pernyi），主要分布在10余個省份。目前保存著上百個地理種群或生態(tài)類型，如山東的客嶺莊種、河南的魯山種、遼寧的璦陽種、貴州的湄潭種以及用顏色命名的青皮蠶、黃皮蠶、青黃蠶、銀白蠶、藍(lán)靛蠶等[1]。這些品種都是經(jīng)過長期的人工選擇培育以及自然突變逐漸形成的具有不同生理、遺傳特性和區(qū)域適應(yīng)性的柞蠶品種，其經(jīng)濟(jì)性狀各具特征[2]。

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，可以通過DNA大分子本身來分析遺傳差異，為物種的起源、親緣關(guān)系和進(jìn)化研究開辟了一個新的途徑。這些研究所提供的大量客觀的分子水平上的信息，非常有力地推動了物種起源、親緣關(guān)系和進(jìn)化的研究。20世紀(jì)90年代發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)，特別是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、選擇性擴(kuò)增DNA片段（selective amplification DNA fragments，簡稱SADF）等技術(shù)[3-7]，以其快速方便的特點(diǎn)，在核酸分子水平上為物種的多態(tài)性提供了豐富的信息，從而被廣泛應(yīng)用于物種遺傳變異、進(jìn)化和親緣關(guān)系等研究領(lǐng)域。這些技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)揭示了許多物種種內(nèi)或種間的遺傳進(jìn)化與親緣關(guān)系，如亞洲玉米螟地理種群分化的研究[8]、蚱屬種間親緣關(guān)系研究[9]、我國野桑蠶和家蠶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究等[10]。目前已利用這些標(biāo)記技術(shù)成功地構(gòu)建了家蠶的連鎖圖[11-14]。在柞蠶上，此方面的研究也已經(jīng)開展起來[15]，劉彥群等利用RAPD標(biāo)記分析4種體色柞蠶品種的遺傳關(guān)系，表明品種的遺傳聚類劃分與體色之間的相關(guān)性不大，柞蠶體色并不能真實反映品種間的遺傳關(guān)系[16];靳向東等作了廣適性大型多絲量柞蠶新品種選育報告，將柞蠶品種資源研究運(yùn)用于新品種選育中，育成2個多絲量柞蠶新品種[17]。在技術(shù)上，RAPD技術(shù)已被應(yīng)用在多種動植物上，如農(nóng)志歡等在十大功勞屬6個種上[18]、李言等在海帶上[19]、石洪玥等在中華絨螯蟹上[20]、陳德西等在蝗蟲上[21]都利用RAPD技術(shù)開展了種質(zhì)資源的研究。目前，國內(nèi)的研究主要集中在家蠶、玉米、水稻等生物的種質(zhì)資源方面，有關(guān)柞蠶種質(zhì)資源遺傳進(jìn)化、分類以及親緣關(guān)系的研究在深度和廣度上有待完善。因此，本研究采用RAPD技術(shù)對71個柞蠶品種的分類和親緣關(guān)系進(jìn)行了聚類分析，以確立品種間的親緣關(guān)系，以期對我國這一特有生物資源開展進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

收集我國遼寧、河南、吉林、山東與內(nèi)蒙古等地的不同地理種群和不同化性的柞蠶品種（表1）[22-26]。本研究在大連理工大學(xué)生命科學(xué)實驗室完成。

參照美國Operon公司設(shè)計的含有10個寡核苷酸隨機(jī)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。RAPD反應(yīng)系統(tǒng)購自北京鼎國生物工程有限公司。Protease K（蛋白酶K）、RNaseA購自美國Promega公司，瓊脂糖為西班牙產(chǎn)，其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 柞蠶基因組DNA的提取 取液氮中冷凍的單個柞蠶蛹組織0.5 g研磨[27]，加入2 mL提取緩沖液[10 mmol/L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）-HCl pH值8.0，0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5% 十二烷基硫酸鈉（SDS），50 μg/mL 蛋白酶K]，在50～60 ℃保溫3 h[28-31]。加入等體積的酚混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min;取上層液加入等體積的酚/三氯甲烷抽提1次。最后用2/3體積的異丙醇沉淀，用75%乙醇洗沉淀1次。溶于400 μL TE中，加RNase于37 ℃消化30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 參照Williams等的方法[3]對隨機(jī)擴(kuò)增具有影響的反應(yīng)參數(shù)， 如鎂離子、引物、模板濃度、dNTP和Taq酶用量等進(jìn)行優(yōu)化[32-34]。25 μL反應(yīng)液中，含2 U Taq酶、2.5 μL 10×緩沖液（1.5 mmol/L MgCl2+10 mmol/L Tris-HCl+50 mmol/L KCl+0.01%明膠）、dNTP（各200 umol/L）和Primer（10 pmol/L）各1.0 μL、DNA模板1.0 μL（100 ng）。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán); 72 ℃延伸10 min。

1.2.3 RAPD多態(tài)性分析 每個柞蠶品種取6個個體，分別提取DNA后混合作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠中恒壓電泳2 h，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后在紫外分析儀下觀察拍照，選取重復(fù)性好且亮度較強(qiáng)的條帶進(jìn)行統(tǒng)計分析[35]。在電泳圖譜上同一RAPD位點(diǎn)上有電泳帶者記為1，無電泳帶者記為0。根據(jù)Nei的公式：I=2NXY/（NX+NY）[36]，計算出任意2個個體（群體或物種）間的遺傳距離D和遺傳相似系數(shù)I。式中：NXY為兩者共同擁有譜帶（RAPD標(biāo)記）的數(shù)目;NX和NY分別為X和Y個體（或群體、物種）各自擁有的全部譜帶數(shù)。遺傳距離的計算和系統(tǒng)聚類采用NTSYS-PC 2.10e[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及PCR擴(kuò)增

采用已經(jīng)確定的反應(yīng)體系和條件，以小黃皮、魯黃、寬青和抗病2號的DNA作為模板，對7組共140條隨機(jī)引物進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，結(jié)果共篩選出有效引物60條，再從中篩選出較好的引物28條（表2）。對71個柞蠶品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共得到92條清晰的具有多態(tài)性的譜帶，占總帶數(shù)的29%，片段大小介于500～3 000 bp間，平均每條引物可擴(kuò)增3條具有多態(tài)性的譜帶。多態(tài)性譜帶最多的引物為OPM10（5條），最少的為OPG3（2條）?？梢姴煌锏臄U(kuò)增產(chǎn)物均有顯著差異，其中引物OPH19的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。此外，不同品種擴(kuò)增的具有多態(tài)性的帶數(shù)亦不相同，其中多態(tài)性譜帶最多的品種為印度柞蠶，共有35條，最少的為青6號，只獲得16條。

2.2 柞蠶品種間的親緣關(guān)系分析

將每個DNA片段看作1個可區(qū)分的RAPD標(biāo)記，根據(jù)Nei的公式[36]計算出71份柞蠶品種間的遺傳相似系數(shù)（I）和遺傳距離（D）。結(jié)果顯示：2個河南一化性品種731與云白的相似系數(shù)最高，達(dá)到0.886 7，可見兩者間的遺傳背景比較接近;二化品種黃安東與一化品種豫5號的相似系數(shù)為 0.867 1，表明兩者之間也有較近的親緣關(guān)系。一化性品種河41同白一化、豫早1號同201、豫早2號同魯松、魯黃同松黃等4對品種的相似系數(shù)都在0.785 7以上，表明這些品種間的親緣關(guān)系較近。而河41、白一化與其他河南一化性品種的相似系數(shù)均低于0.486 2，表明這2個品種與其他一化性品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對不同化性和不同地理區(qū)域的71個柞蠶品種根據(jù)遺傳距離（D）進(jìn)行聚類分析。由圖2可以看出，大部分的河南一化品種分布在不同的類群中，并且在各個類群中首先聚到一起。但是，也有不同地區(qū)與化性的品種能夠較早地聚在一起，如黃安東與豫5號，它們僅次于河南一化性品種731與云白，第2次就聚在一起。圖2還說明，各個地區(qū)與不同化性的柞蠶品種之間親緣關(guān)系沒有明顯區(qū)別，遺傳類型相互混雜。

2.3 不同地區(qū)柞蠶種群的DNA多態(tài)性聚類分析

為了進(jìn)一步揭示不同地理區(qū)域間柞蠶品種的遺傳進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)每個柞蠶品種的最初來源，選擇具有代表性的、背景清楚的品種作為該地區(qū)的代表性品種（表3）。

將表2中來自同一個地區(qū)的所有代表性品種的標(biāo)記作為該地區(qū)種群的RAPD標(biāo)記，進(jìn)行不同地區(qū)柞蠶種群的遺傳距

離（D）分析（表4）。

利用表3數(shù)據(jù)，用UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖。從圖3可以看出，來自河南地區(qū)的種群與遼寧地區(qū)的種群首先聚類到一起， 兩者之間的遺傳距離只有0.066 3。山東與遼寧、山東與河南種群的遺傳距離分別為0.104 2、0.126 1。除了四川與湖北、四川與印度的遺傳距離分別為0.693 1、0.665 0（>0.5）外，其他地區(qū)之間的遺傳距離都<0.5。

3 結(jié)論與討論

柞蠶為鱗翅目（Lepidoptera）天蠶蛾科（Saturniidae）的絹絲類昆蟲，已記載的共有35個種，其中31個種分布在印沃區(qū)，3個在古北區(qū)，1個在北美區(qū)。為人們所熟知并用于商業(yè)性生產(chǎn)的有中國柞蠶（Antheraea pernyi）、2種印度柞蠶（Antheraea assamensis和Antheraea mylitta）和日本天蠶（Antheraea yamamai）。

我國現(xiàn)存130多個品種都是中國柞蠶的變種和地理種或生態(tài)型。各個品種之間的血緣關(guān)系非常復(fù)雜，各個品種之間既有高度變異的一面，又有親緣很近的一面。劉彥群等通過對河41、四青、青黃1號和杏黃4個品種的研究發(fā)現(xiàn)，在DNA水平上的分類并沒有按體色進(jìn)行[38]，對現(xiàn)行的體色分類系統(tǒng)提出了質(zhì)疑。

本研究表明，不同的品種，即使分布相距很遠(yuǎn)，有的竟表現(xiàn)出驚人的相似性和緊密的親緣關(guān)系;而同一個品種的不同生態(tài)型，有的卻相差懸殊。如在對71個柞蠶品種進(jìn)行RAPD多態(tài)性聚類分析時發(fā)現(xiàn)，整個系統(tǒng)聚類圖分為2支，每個分支中各地區(qū)的品種相互摻雜。但是在第一集團(tuán)的40個品種中，一化性品種有15個，占37.5%;在第二集團(tuán)31個品種中，一化性品種只有8個，占25.8%。從整個系統(tǒng)聚類圖上可以看出，大部分的一化品種分布在不同的類群中，并且在各個類群中首先分別聚到一起。河南的一化性品種731與云白的相似系數(shù)最高，達(dá)到了0.886 7，可見兩者間的遺傳背景非常接近;一化性品種河41同白一化、豫早1號同201、豫早2號同魯

松、魯黃同松黃4對品種的相似系數(shù)也都在0.785 7以上，表明這些品種間的親緣關(guān)系較近。但是，也有不同地區(qū)與化性的品種能夠較早地聚在一起，如黃安東與豫5號，它們僅次于2個河南一化性品種731與云白，相似系數(shù)為0.867 1。

有關(guān)柞蠶的分布與分化，印度學(xué)者喬利認(rèn)為，生長在熱帶的印度柞蠶（A.assamensis）是柞蠶的原始類型，其他品種都起源于它，我國境內(nèi)的柞蠶是由印度東北向我國南部傳播的[39]。本研究結(jié)果表明，遼寧地區(qū)的品種首先與河南地區(qū)的品種聚在一起，然后又與山東地區(qū)的品種聚在一起。以0.728 1為分界，除了貴州以外，包括朝鮮在內(nèi)的長江以北的地區(qū)品種首先聚類在一起，這一集團(tuán)中包括我國2個古代柞蠶傳播中心——山東和河南與現(xiàn)代柞蠶的傳播中心遼寧。印度柞蠶最早從整個系統(tǒng)中分離出來，然后是四川、湖北。雖然在古文獻(xiàn)中沒有找到有關(guān)這些地區(qū)柞蠶品種起源的記載，但是從系統(tǒng)聚類圖中可以推測，在遠(yuǎn)古的時候柞蠶由印度傳到我國后，由四川經(jīng)湖北向長江以北地區(qū)傳播，到達(dá)我國古代柞蠶傳播中心山東、河南與現(xiàn)代柞蠶的傳播中心遼寧。然后又從這些地區(qū)向吉林、貴州以及朝鮮等地傳播，所以發(fā)現(xiàn)吉林、貴州以及朝鮮的品種又從這些品種中分化出來。在最后剩下的遼寧、河南、山東的品種中，遼寧與河南分化得最晚;長江以北的地區(qū)品種的分化情況基本上與歷史資料的記載相吻合[1]。

現(xiàn)代遺傳學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為物種的遺傳性狀是由基因決定的，各種外部形態(tài)及內(nèi)部性狀的變異都是由于基因中DNA分子堿基序列發(fā)生改變。本研究在分子水平上對我國柞蠶品種資源的遺傳分化和親緣關(guān)系進(jìn)行了探討，可能與已有的研究不完全相符，期望有助于對我國這一特有生物資源的保護(hù)和深入研究。

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