朱敏嘉 黃俊華 楊文英

摘要：為掌握裕民貝母種子形態(tài)休眠生理因子的響應(yīng)機(jī)制，探討外源GA3對(duì)營養(yǎng)指標(biāo)的影響，對(duì)GA3 0 mg/L和GA3 30 mg/L 這2個(gè)處理營養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，種子形態(tài)休眠解除過程中：（1）相對(duì)含水量和自由水含量增加，束縛水含量減少，細(xì)胞代謝能力增強(qiáng);（2）粗脂肪和淀粉持續(xù)降解為可利用的小分子化合物;（3）可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)以及氨基酸滿足前期積累后期消耗的特點(diǎn)，種子首先利用可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸，隨后吸收可溶性糖;（4）GA3 30 mg/L處理能增強(qiáng)營養(yǎng)指標(biāo)活躍程度，并且還可以提前動(dòng)員氨基酸。

關(guān)鍵詞：裕民貝母;種子形態(tài)休眠;休眠解除;赤霉素（GA3）;營養(yǎng)物質(zhì)

中圖分類號(hào)： Q945.35? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0182-04

新疆貝母屬資源豐富，種類獨(dú)特，其中裕民貝母（Fritillaria yuminensis X. Z. Duan）葉形奇特、花色艷麗，作為貝母屬中的原始種群[1]，它是唯一開藍(lán)花的貝母[2]，極具觀賞價(jià)值，以種子和鱗莖繁殖為主[3]。生物堿是衡量植物藥用價(jià)值的重要標(biāo)準(zhǔn)，裕民貝母鱗莖、葉及莖中均存在生物堿，并且生物堿總量遠(yuǎn)超疆內(nèi)其他貝母，說明其藥用價(jià)值突出[4]。由于裕民貝母的觀賞及藥用價(jià)值備受關(guān)注，導(dǎo)致其被過度采挖、數(shù)量銳減，因此保護(hù)和開發(fā)利用該種質(zhì)資源刻不容緩。采集和研究裕民貝母種子可為野生撫育和人工栽培提供基礎(chǔ)材料，這對(duì)種質(zhì)保育、開發(fā)利用以及引種馴化具深刻意義。

已有研究表明外源赤霉素（GA3）[5-7]在破除貝母屬種子休眠方面頗有成效，前人雖然從可溶性蛋白質(zhì)角度分析了浙貝母種子休眠特性[8]，但缺乏對(duì)裕民貝母種子休眠的生理研究。段咸珍等[9]曾指出裕民貝母種子需完成形態(tài)及生理雙重后熟才具發(fā)芽潛力，根據(jù)Baskin等[10-11]對(duì)植物休眠的劃分，該種子屬于形態(tài)生理休眠類型。本試驗(yàn)選取裕民貝母種子為研究對(duì)象，采用外源GA3打破種子形態(tài)休眠，通過分析營養(yǎng)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，闡述種子形態(tài)休眠解除過程中營養(yǎng)指標(biāo)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用裕民貝母種子于2017年7月采集于新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)裕民縣江克斯鄉(xiāng)附近（45°56′～46°10′ N，82°39′～82°67′ E，海拔759～1 080 m）。江克斯鄉(xiāng)屬于典型的大陸型干旱氣候，年平均氣溫6.5 ℃，年平均無霜期153 d，蒸發(fā)量大，降水量少，冬長夏短，冷暖變幅大[12]。

設(shè)置GA3 0 mg/L（CK）和GA3 30 mg/L 2個(gè)處理。每處理取8 g鮮種子，重復(fù)3次，消毒后蒸餾水浸種1 d，次日轉(zhuǎn)入各自GA3溶液浸種3 d，最后置于培養(yǎng)皿中，放入 5/10 ℃ 的RTOP-268Y智能人工氣候箱（浙江托普公司）進(jìn)行暗環(huán)境培養(yǎng)。CK處理下種子形態(tài)休眠解除需80 d，GA3 30 mg/L 處理僅需60 d。

1.2 試驗(yàn)方法

CK和GA3 30 mg/L處理每隔20 d各取3 g鮮種子進(jìn)行粗脂肪含量測定，其他指標(biāo)均取1 g鮮種子，每處理重復(fù)3次。其中，水分含量測定采用阿貝折射儀法[13]，粗脂肪含量測定采用索氏提取法[13]，淀粉含量測定采用高氯酸水解法結(jié)合蒽酮比色法[13]，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[13]，氨基酸含量測定采用水合茚三酮法[13]。公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

SPSS 18.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Duncans方差分析檢驗(yàn)單因素（One-Way ANOVA），Photoshop CS6軟件處理圖片，Microsoft Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 裕民貝母種子水分的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子形態(tài)休眠解除過程中，2個(gè)處理隨時(shí)間延長相對(duì)含水量緩慢遞增，且GA3 30 mg/L處理的相對(duì)含水量始終高于CK，但兩者相差不大（圖1）。0 d時(shí)，2個(gè)處理相對(duì)含水量均為61.77%;20 d時(shí)，GA3 30 mg/L處理吸水速度快于CK，2個(gè)處理相對(duì)含水量急劇增高，CK達(dá)72.21%，GA3 30 mg/L 處理達(dá)74.36%。40 d時(shí)，CK相對(duì)含水量的增速略微高于GA3 30 mg/L處理，并且CK相對(duì)含水量逐漸追至 74.56%，GA3 30 mg/L處理則緩慢增至75.15%;60 d時(shí)，2個(gè)處理均保持較低的吸水速率，CK相對(duì)含水量攀升至 75.64%，GA3 30 mg/L處理則攀升至76.31%;80 d時(shí)，GA3 30 mg/L處理增速再次高于CK，CK相對(duì)含水量為78.35%，GA3 30 mg/L處理相對(duì)含水量為79.42%。100 d時(shí)，2個(gè)處理相對(duì)含水量最高，GA3 30 mg/L處理以80.78%高出CK處理1.55百分點(diǎn)。

裕民貝母種子形態(tài)休眠解除過程中，2個(gè)處理隨時(shí)間延長自由水含量有所提高，且GA3 30 mg/L處理的自由水含量始終高于CK（圖2）。0 d時(shí)，CK自由水含量為32.44%，GA3 30 mg/L處理自由水含量為34.74%，兩者僅相差2.30百分點(diǎn);20 d 時(shí)，CK自由水含量變化不明顯，而GA3 30 mg/L處理猛增至50.65%;40 d時(shí)，CK自由水含量雖以高于GA3 30 mg/L 處理的增速達(dá)到49.74%，但此時(shí)GA3 30 mg/L處理已達(dá) 62.68%;60 d時(shí)，CK仍保持一定增速至自由水含量為 55.01%，但是GA3 30 mg/L處理自由水含量變化不顯著;80 d 時(shí)，2個(gè)處理自由水含量均以較高增速遞增，CK為 62.50%，GA3 30 mg/L處理為70.05%;100 d時(shí)，CK自由水含量持續(xù)升高至66.56%，GA3 30 mg/L處理自由水含量穩(wěn)定在70.05%，兩者差距最小。

裕民貝母種子形態(tài)休眠解除過程中，CK處理隨時(shí)間延長束縛水含量先升后降，GA3 30 mg/L處理處理隨時(shí)間延長束縛水含量則先降后升，但CK的束縛水含量始終高于GA3 30 mg/L處理（圖3）。0 d時(shí)，CK束縛水含量為29.34%，GA3 30 mg/L處理束縛水含量為27.03%，兩者僅相差2.31百分點(diǎn);20 d 時(shí)，CK束縛水含量升高至37.99%，GA3 30 mg/L處理則下降至23.71%;40 d時(shí)，CK束縛水含量開始下降至 24.82%，而GA3 30 mg/L處理減少到12.46%;60 d時(shí)，CK束縛水含量持續(xù)遞減至20.63%，GA3 30 mg/L處理卻穩(wěn)定在11.93%;80 d時(shí)，CK束縛水含量以一定減速跌至15.85%，GA3 30 mg/L處理束縛水含量稍微下降至9.36%;100 d時(shí)，CK束縛水含量最終低至12.67%，GA3 30 mg/L處理回升到10.71%，兩者差距1.96百分點(diǎn)。

2.2 裕民貝母種子粗脂肪的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子打破形態(tài)休眠期間，2個(gè)處理隨時(shí)間延長粗脂肪含量不斷降低，且CK粗脂肪含量始終高于GA3 30 mg/L 處理（圖4）。0 d時(shí)，2個(gè)處理的粗脂肪含量不相上下，CK為1.25%，GA3 30 mg/L處理為1.26%;20 d時(shí)，CK粗脂肪含量未發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，而GA3 30 mg/L處理稍有回落;40 d時(shí)，2個(gè)處理的粗脂肪均被迅速分解，CK含量降為 1.00%，GA3 30 mg/L處理則降為0.79%;60 d時(shí)，2個(gè)處理粗脂肪代謝緩慢，CK僅下降了0.06百分點(diǎn)，GA3 30 mg/L處理則下降了0.08百分點(diǎn);80 d時(shí)，CK粗脂肪以高于GA3 30 mg/L處理的轉(zhuǎn)化率降至0.82%，此時(shí)GA3 30 mg/L處理粗脂肪含量為 0.68%;在100 d時(shí)，2個(gè)處理的粗脂肪含量再次暴跌，CK低至0.51%，GA3 30 mg/L處理低至0.47%。

2.3 裕民貝母種子淀粉的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子打破形態(tài)休眠期間，2個(gè)處理隨時(shí)間延長淀粉含量整體呈下降趨勢，且CK淀粉含量始終高于GA3 30 mg/L 處理（圖5）。0 d時(shí)，2個(gè)處理淀粉含量初始值一致，均為1.00%;20 d時(shí)，CK消耗了0.01百分點(diǎn)的淀粉，GA3 30 mg/L 處理則消耗了0.02百分點(diǎn);40 d時(shí)，2個(gè)處理的淀粉大量水解，此時(shí)CK淀粉含量為0.97%，GA3 30 mg/L處理為0.96%，兩者僅相差0.01百分點(diǎn);相比40 d而言，60 d時(shí)兩者淀粉含量均減少0.01百分點(diǎn);80 d時(shí)，CK淀粉低至0.95%，GA3 30 mg/L處理低至0.94%;100 d時(shí)，2個(gè)處理淀粉含量以相同消耗率降至最低值，CK為0.94%，GA3 30 mg/L處理為0.93%。

2.4 裕民貝母種子可溶性糖的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子形態(tài)破眠階段，2個(gè)處理隨時(shí)間延長可溶性糖含量前期攀升后期下降，且GA3 30 mg/L處理含量始終高于CK（圖6）。0 d時(shí)，2個(gè)處理可溶性糖含量初始值的差距非常小，CK為0.55%，GA3 30 mg/L處理為0.59%;20 d時(shí)，GA3 30 mg/L處理增速高于CK，CK可溶性糖含量升至 0.67%，而GA3 30 mg/L處理升至0.84%;40 d時(shí)，兩者可溶性糖含量幾乎保持相同增率繼續(xù)上升，此階段CK含量為 0.75%，GA3 30 mg/L處理則為0.93%;60 d時(shí)，兩者可溶性糖含量的增速進(jìn)一步提高，CK含量達(dá)1.01%，GA3 30 mg/L處理則達(dá)1.21%;80 d時(shí)，CK可溶性糖含量高達(dá)1.73%，GA3 30 mg/L處理高達(dá)1.95%，此后2個(gè)處理可溶性糖含量均急劇減少，說明0～80 d裕民貝母種子中的營養(yǎng)物質(zhì)積累異?；钴S;100 d時(shí)，2個(gè)處理可溶性糖繼續(xù)降解，說明此時(shí)種子開始吸收可溶性糖進(jìn)行生理活動(dòng)。

2.5 裕民貝母種子可溶性蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子形態(tài)破眠階段，可溶性蛋白質(zhì)含量首先升高然后才下降，并且2個(gè)處理在同一時(shí)刻達(dá)到最大值，僅升降幅度有所變化，上升階段GA3 30 mg/L處理含量始終大于CK，但下降階段GA3 30 mg/L處理含量先高于CK隨后立即低于CK（圖7）。0 d時(shí)，2個(gè)處理初始值一致;20 d時(shí)，CK含量變化不大，GA3 30 mg/L處理則小幅上升;40 d時(shí)，2個(gè)處理含量激增至最大值;60 d時(shí)，2個(gè)處理同步下降，此階段GA3 30 mg/L 處理含量略高于CK;80 d時(shí)，2個(gè)處理含量進(jìn)一步下跌，其中GA3 30 mg/L處理降速高于CK，并且GA3 30 mg/L處理含量開始逐步低于CK;100 d時(shí)，2個(gè)處理含量均最小，但是GA3 30 mg/L處理含量仍低于CK。綜上，可溶性蛋白質(zhì)在0～40 d迅速積累，40～100 d快速降解為胚發(fā)育提供能量。

2.6 裕民貝母種子氨基酸的動(dòng)態(tài)變化

裕民貝母種子形態(tài)破眠階段，2個(gè)處理隨時(shí)間延長氨基酸含量變化大致相同，均先升后降，僅峰值時(shí)間點(diǎn)有所不同，GA3 30 mg/L處理比CK提前20 d到達(dá)峰值，上升階段GA3 30 mg/L處理氨基酸含量始終高于CK，但下降階段GA3 30 mg/L 處理氨基酸含量始終低于CK（圖8）。0 d時(shí)，2個(gè)處理初始值相同;20 d時(shí)，2個(gè)處理含量快速上升，并且GA3 30 mg/L 處理含量高于CK;40 d時(shí)，2個(gè)處理含量加速提高，GA3 30 mg/L處理含量率先到達(dá)頂峰值;60 d時(shí)，CK含量繼續(xù)上升至最高值，與GA3 30 mg/L處理峰值大致相同，但是此時(shí)GA3 30 mg/L處理含量開始下降;80 d時(shí)，CK含量處于遞減階段，而GA3 30 mg/L處理降速進(jìn)一步增大;100 d時(shí)，2個(gè)處理含量均跌落至最低值。

3 討論

水分作為可以直接參與植物生命活動(dòng)的關(guān)鍵因子，具有自由水和束縛水2種不同的表達(dá)形式，生命體的發(fā)育過程以及抗逆性均與自由水和束縛水緊密相關(guān)，當(dāng)自由水含量高時(shí)細(xì)胞生理活動(dòng)旺盛并且植物能迅速生長發(fā)育，反之植物抗逆性強(qiáng)[14]。植物組織的相對(duì)含水量能夠反映該組織含水情況，自由水則能夠直接參與植物生理活動(dòng)，而束縛水能夠保護(hù)細(xì)胞彈性和完整性[15]。水分與休眠存在一定聯(lián)系，當(dāng)植物組織中的水分減少時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)將過度積累，酶活性也會(huì)受到抑制，從而進(jìn)入休眠狀態(tài)[16]。本研究表明，裕民貝母種子的相對(duì)含水量持續(xù)增加，種子已進(jìn)入休眠解除狀態(tài)，這一特性與青錢柳[17]相同;自由水含量不斷上升，種子中的營養(yǎng)物質(zhì)被調(diào)動(dòng)，分解轉(zhuǎn)化為可供胚生長利用的可溶性物質(zhì)，關(guān)鍵酶被激活，從而誘發(fā)更好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);束縛水含量的降低意味著種子當(dāng)前環(huán)境十分良好，不受逆境脅迫;自由水含量多于束縛水，能夠保證種子維系正常細(xì)胞代謝活動(dòng)，加速胚的生長發(fā)育;GA3 30 mg/L處理下種子的相對(duì)含水量、自由水含量自始至終高于CK，但是束縛水含量一直低于CK，推測外源GA3能積極調(diào)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)部的生理活動(dòng)。

脂肪酸及甘油均是脂肪通過脂肪酶水解的產(chǎn)物，它們不僅有利于新細(xì)胞的構(gòu)建，并且脂肪酸可通過氧化磷酸化釋放能量供種子生長，而甘油則可直接參與種子糖類代謝活動(dòng)[18]。粗脂肪作為種子形態(tài)休眠解除的啟動(dòng)物質(zhì)之一，其含量的減少反映出種子代謝活躍，大自然中許多種子存在此類現(xiàn)象，裕民貝母種子亦是如此。整個(gè)種子形態(tài)破眠中，粗脂肪一直處于消耗狀態(tài)，并且GA3 30 mg/L處理含量始終低于CK，充分體現(xiàn)了外源GA3分解利用脂肪的能力更強(qiáng)。

淀粉是開啟種子生命活動(dòng)的主要碳源，經(jīng)淀粉酶催化產(chǎn)生細(xì)胞呼吸底料“可溶性糖”供胚利用[19]。裕民貝母種子形態(tài)破眠時(shí)不斷消耗淀粉，導(dǎo)致淀粉含量持續(xù)減少，情況與人參屬[19]一致;GA3 30 mg/L處理消耗淀粉的能力明顯強(qiáng)于CK，彰顯了外源GA3可以加速淀粉水解的特點(diǎn)。

可溶性糖作為種子可以吸收利用的小分子化合物，不僅能夠參與細(xì)胞的呼吸作用，還能夠促進(jìn)胚生長發(fā)育，多由淀粉水解產(chǎn)生，或脂肪、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化而來[20]。本試驗(yàn)顯示，前80 d裕民貝母種子可溶性糖含量不斷增加，可能與關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)從而導(dǎo)致淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)被加速分解有關(guān);80 d后胚結(jié)構(gòu)日益完整，可溶性糖含量開始減少，與種子相對(duì)含水量升高致細(xì)胞呼吸作用增強(qiáng)有關(guān)，此時(shí)種子糖類代謝旺盛[21]。裕民貝母種子可溶性糖前期攀升后期降低的情況與黃精[22]相似，并且GA3 30 mg/L處理可溶性糖含量始終高于CK，凸顯出外源GA3能夠積累更多的呼吸底物。

可溶性蛋白質(zhì)作為種子的重要養(yǎng)料以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞構(gòu)建、酶的組成、生物膜透性起至關(guān)重要的作用。Horner等[23]曾指出種子中某些細(xì)胞在原始蛋白質(zhì)未被消耗的情況下還會(huì)合成新的蛋白質(zhì)，裕民貝母種子在0～40 d時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)增加，可能與新的蛋白質(zhì)合成有關(guān)，同屬植物浙貝母[8]也有類似情況。40 d時(shí)，GA3 30 mg/L處理以及CK都是達(dá)到峰值后才開始下降，兩者動(dòng)員可溶性蛋白質(zhì)的時(shí)間完全相同;上升階段GA3 30 mg/L處理含量始終稍高于CK，但下降階段GA3 30 mg/L處理含量先高于CK隨后立即低于CK，綜上可知外源GA3有利于可溶性蛋白質(zhì)的積累與消耗，從而使種子產(chǎn)生更劇烈的生命活動(dòng)。

氨基酸不僅是種子可吸收的小分子，也是蛋白質(zhì)的組成單位，同時(shí)還是植物內(nèi)源激素形成的前體，通過參與細(xì)胞氮類代謝來調(diào)節(jié)碳氮平衡，對(duì)種子生理具積極作用[24]。裕民貝母種子氨基酸含量表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，種子前期在積累氨基酸，后期消耗過程中一部分氨基酸被種子直接吸收利用，另一部分用于蛋白質(zhì)和內(nèi)源激素的合成，GA3 30 mg/L 處理消耗氨基酸的時(shí)間集中在40～100 d，CK則集中在60～100 d。GA3 30 mg/L處理處理下氨基酸含量40 d達(dá)到峰值，比CK提前20 d，雖然上升階段2個(gè)處理峰值大致相同，但GA3 30 mg/L處理增速高于CK，這表示GA3 30 mg/L處理不僅利于氨基酸的積累并且能提前動(dòng)員氨基酸發(fā)揮作用;下降階段GA3 30 mg/L處理氨基酸含量始終低于CK，側(cè)面反映出GA3 30 mg/L處理氮類代謝比CK活躍。

4 結(jié)論

隨胚逐漸發(fā)育完善，種子相對(duì)水含量小幅增長，自由水含量顯著增多，束縛水含量則相對(duì)降低，且束縛水含量低于自由水含量，由此可見水分是保證種子生理活動(dòng)的關(guān)鍵因子。粗脂肪和淀粉含量自始至終處于下降狀態(tài)，兩者在為胚提供能量時(shí)發(fā)生了持續(xù)性降解，揭示了粗脂肪和淀粉是種子形態(tài)破眠期間最先動(dòng)員的營養(yǎng)物質(zhì)?？扇苄蕴?、可溶性蛋白質(zhì)以及氨基酸含量則先升后降，3種物質(zhì)需要積累到一定程度才能調(diào)節(jié)種子的生理活動(dòng);其中可溶性糖含量前80 d與粗脂肪、淀粉存在一定負(fù)向關(guān)系，顯示出該物質(zhì)前期積累主要來自粗脂肪和淀粉的降解與轉(zhuǎn)化，后期消耗主要源于種子的呼吸作用;可溶性蛋白質(zhì)40 d后含量開始減少，該物質(zhì)主要在種子形態(tài)破眠后期提供能量;GA3 30 mg/L處理在40 d時(shí)開始啟動(dòng)氨基酸，比CK早20 d，前期該含量增加是為合成相關(guān)蛋白質(zhì)做準(zhǔn)備，后期含量減少與參與種子氮類代謝有關(guān)。

形態(tài)休眠被認(rèn)為是種子植物中古老且原始的休眠類型[25]，裕民貝母種子存在形態(tài)生理休眠，是一種較進(jìn)化的休眠類型。外源GA3的攝入可以調(diào)控營養(yǎng)指標(biāo)之間的生理作用，從而保證種子的正常生命活動(dòng)，促進(jìn)胚外部形態(tài)的建成，加速種子形態(tài)休眠的解除。本研究僅初步探討了裕民貝母種子形態(tài)休眠期間營養(yǎng)物質(zhì)的生理變化，關(guān)于種子內(nèi)源抑制物、關(guān)鍵酶、內(nèi)源激素等生理指標(biāo)尚未涉及，今后可結(jié)合種子生理學(xué)、分子生物學(xué)進(jìn)一步系統(tǒng)闡述其種子形態(tài)休眠的破除機(jī)理，以期為該種子生理休眠研究提供科學(xué)參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：