王攀 范娜

摘要：以核桃餅粕為原料，研究優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕制備抗氧化活性多肽的工藝條件。通過研究酶解溫度、酶解時間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值對酶解產物抗氧化活性的影響，正交優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并將酶解物利用葡聚糖凝膠層析柱進行分離，測定其抗氧化活性。結果表明，當木瓜蛋白酶在酶解溫度為60 ℃、酶解時間為 3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 mL、加酶量為6 500 U/g、pH值為6.5的酶解條件下，酶解物的抗氧化活性較好，酶解液對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）和羥基自由基的清除率分別為52.24%和53.20%;酶解液經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱分離，酶解物分離多肽的分子量越大，抗氧化活性越低。

關鍵詞：核桃餅粕;木瓜蛋白酶;抗氧化活性;生物活性肽

中圖分類號： TS209? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0238-04

收稿日期：2018-03-09

基金項目：陜西省農業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目（編號：2016NY-147）;商洛學院服務地方經(jīng)濟社會發(fā)展專項（編號：2015SKY-FWDF004）。

作者簡介：王 攀（1983—），男，陜西寶雞人，碩士，講師，主要從事農產品綜合利用及新產品開發(fā)。Tel：（0914）2398182;E-mail：w1p2004@163.com。? 核桃營養(yǎng)價值較高，含有豐富的油脂和蛋白質，在工業(yè)生產中常被作為榨油用料[1]，核桃餅粕是核桃油深加工的副產物[2]，大多作為動物飼料，目前對其利用具有一定的局限性，主要集中于蛋白質與多肽的開發(fā)方面[3]。雖然核桃餅粕中蛋白質含量高達30%～50%[4]，但核桃蛋白溶解性較低[5]，限制了食品加工中核桃蛋白的利用[6]。近年來，對核桃餅粕的深加工已逐步開展起來，主要是利用核桃餅粕制備核桃多肽[7]，核桃多肽不僅具有良好的溶解性，而且還具有易消化吸收、促進微生物發(fā)酵以及抗氧化等生理活性[6]。抗氧化肽是一種具有抗氧化活性的生物活性肽，具有清除體內自由基的功能，是一種潛在的、可以利用的外源性抗氧化物質[8]，且采用酶水解核桃蛋白可以制得具有抗氧化活性的生物活性肽[9]。本研究主要以核桃餅粕為原料，通過研究酶解溫度、酶解時間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值等因素對木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕產物抗氧化活性的影響，正交優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并對酶解物利用葡聚糖凝膠層析柱進行分離，考察分離物的抗氧化活性，以期為核桃餅粕抗氧化活性多肽的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料與試劑 核桃餅粕，購自洛南食品加工廠;木瓜蛋白酶（酶活性100 000 U/g），購自南寧宏博生物工程有限公司;DPPH，購自Sigma公司;無水乙醇、乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、H2O2溶液、鄰二氮菲均為分析純。

1.1.2 試驗設備 FA1004型電子分析天平，購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;755B型紫外可見分光光度計，購自上海精密科學儀器有限公司;TDL-40B型低速臺式離心機，購自上海安亭科學儀器廠;HH-4型電熱恒溫水浴鍋，購自北京科偉永興儀器有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計，購自上海美析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃蛋白的制備 將10 g核桃餅粕溶解在100 mL磷酸緩沖液（pH值為7.5～10.0）中，調節(jié)溫度至60 ℃，并用NaOH溶液（3.5 mol/L）調節(jié)pH值至8.5～9.0，在溶解過程中不斷攪拌1 h，冷卻后，4 000 r/min離心20 min，取上清液，用HCl（1 mol/L）將pH值調至4.0～5.0，靜置30 min，4 000 r/min 離心20 min，取沉淀低溫干燥或風干，得核桃蛋白，備用[10]。

1.2.2 核桃多肽液的制備 取3 g核桃蛋白溶于100 mL水中，在60 ℃水浴鍋中保溫30 min，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至6.5，并維持pH值和溫度恒定，加入7 000 U/g木瓜蛋白酶，酶解4 h后，沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻后，4 000 r/min 離心15 min，取上清液備用[11]。

1.2.3 單因素試驗 利用木瓜蛋白酶按照“1.2.2”節(jié)的方法酶解核桃餅粕，并固定其他條件，分別單一改變其中酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、底物濃度（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/100 mL）、酶添加量（6 000、6 500、7 000、7 500、8 000 U/g）、酶解時間（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），獲得酶解液，考察核桃餅粕酶解物的抗氧化活性。

1.2.4 正交試驗 在單因素的基礎之上，選擇4個影響較大的因素進行正交試驗，對木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白制備抗氧化多肽的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

1.3 測定方法

1.3.1 清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的測定配制0.02 mol/L DPPH溶液，取2 mL置于試管中，加入 2 mL 無水乙醇搖勻，避光靜置30 min，用無水乙醇作參比，在517 nm下測定吸光度，記為D1;另將2 mL酶解液與2 mL 0.02 mol/L DPPH溶液充分混合，避光靜置30 min，并以2 mL酶解液與 2 mL 無水乙醇混合作為參比測定其吸光度，記為D2[12-14]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

清除率=D1-D2D1×100%。

1.3.2 清除羥基自由基（·OH）能力的測定 采用鄰二氮 菲-Fe2+ 氧化法[12-15]測定核桃餅粕酶解物清除羥基自由基的能力。（1）吸取15 mmol鄰二氮菲應用液 1 mL 放于試管中，先加入pH值為7.5的磷酸緩沖液2 mL以及1 mL的蒸餾水，充分振蕩后加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，立刻混勻，最后加入1% H2O2溶液1 mL，室溫下靜置 1 h。在波長為536 nm處測定吸光度，記為Db;（2）同上，用1 mL蒸餾水代替（1）中的H2O2溶液，在波長為536 nm處測定吸光度，記為Dc;（3）用1 mL酶解液代替（1）中的蒸餾水，在波長為536 nm處測定吸光度，記為Da;羥基自由基清除率計算公式如下：

清除率=Da-DbDc-Db×100%。

1.3.3 Sephadex G-50層析分離核桃蛋白 層析條件如下：層析柱中凝膠為葡聚糖凝膠G-50;柱床體積為1.6 cm×60.0 cm;上樣量為2 mL;流速為0.16 mL/min;緩沖液為去離子水;柱溫為室溫（25 ℃左右）。

用去離子水調節(jié)流速，沖洗凝膠柱，待柱平衡后，取正交試驗最優(yōu)酶解條件下所得的核桃餅粕蛋白多肽液2 mL進行上樣，每小時收集1管，測定其抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 酶解溫度對核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖1可知，木瓜蛋白酶酶解溫度對核桃餅粕酶解物的抗氧化活性有一定的影響。隨酶解溫度的升高，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當酶解溫度為60 ℃時，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達到最高，但隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，抗氧化活性逐漸降低，這主要是由隨溫度的繼續(xù)升高，木瓜蛋白酶的活性在高溫下逐漸降低所致。

2.1.2 底物濃度對核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖2可知，木瓜蛋白酶酶解底物濃度對核桃餅粕酶解物的抗氧化活性有一定的影響。當?shù)孜餄舛葹?.0～2.5 g/100 mL時，隨底物濃度的增加，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性逐漸增強，當?shù)孜餄舛葹?.5 g/100 mL時，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達到最高，但隨底物濃度的進一步增大，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性基本穩(wěn)定。

2.1.3 酶添加量對核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖3可知，木瓜蛋白酶添加量對核桃餅粕酶解物抗氧化活性有明顯的影響，隨酶添加量的增大，核桃餅粕酶解物對DPPH自由基和羥基自由基的清除率均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且核桃餅粕酶解物對DPPH自由基清除率明顯低于羥基自由基。當酶添加量為7 000 U/g時，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達到最高，但當酶添加量在6 500～7 000 U/g范圍內時，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性變化不大。

2.1.4 酶解時間對核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖4可知，木瓜蛋白酶酶解時間對核桃餅粕酶解物抗氧化活性有一定的影響。當酶解時間為3.0～4.0 h時，隨酶解時間的延長，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性變化較小;當酶解時間大于4.0 h時，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性隨酶解時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢;酶解3.5 h時，核桃餅粕酶解物對DPPH自由基和羥基自由基清除率都達到最高，分別為46.73%、47.28%。

2.1.5 酶解pH值對核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖5可知，木瓜蛋白酶酶解pH值對核桃餅粕酶解物抗氧化活性有明顯的影響。隨著酶解pH值的升高，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性先升高后降低;當酶解pH值為6.5時，核桃餅粕酶解物對DPPH自由基和羥基自由基清除率都達到最高，分別為45.64%、46.16%。

2.2 正交試驗結果與分析

根據(jù)單因素試驗結果，以酶解溫度、底物濃度、酶添加量（加酶量）、酶解pH值4個因素進行正交試驗，優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解制備核桃抗氧化多肽工藝條件。

由表2可知，4種因素對DPPH自由基清除率的影響大小依次為溫度>加酶量>pH值>底物濃度，對羥基自由基清除率的影響大小依次為溫度>底物濃度>pH值>加酶量。且最佳水平組合均為A2B2C1D2，即酶解溫度60 ℃、底物濃度2.5 g/100 mL、酶添加量6 500 U/g、酶解pH值6.5，在上述條件下，經(jīng)驗證試驗DPPH自由基清除率達到52.24%，羥基自由基清除率達到53.20%。

2.3 葡聚糖凝膠層析

按照“1.3.3”節(jié)的方法將酶解液過葡聚糖凝膠層析柱，按時間順序，每小時收集1管，共收集7管，并按收集時間進行編號，測每管洗脫液的抗氧化活性，結果見表3。

由表3可知，不同分離物之間抗氧化性存在明顯差異，且當洗脫時間小于1 h或大于6 h時，其分離物無抗氧化活性;當洗脫時間為2～6 h時，隨洗脫時間的延長，分離物的抗氧化活性逐漸增強，洗脫時間為6 h時，分離物的抗氧化活性最強，對DPPH自由基和羥基自由基清除率分別為42.38%和44.49%。根據(jù)凝膠層析分離原理，分子量大的物質先流出凝膠柱，分子量小的物質后流出凝膠柱[16-17]，由此可知，2～6管分離物的分子量依次降低，說明分離物的抗氧化活性隨分子量的減小逐漸增強。

4 結論

木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕時，酶解溫度、酶解時間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值對酶解產物抗氧化活性均有一定的影響，且當木瓜蛋白酶在酶解溫度為60 ℃、酶解時間為3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 mL、加酶量為6 500 U/g、pH值為6.5的酶解條件下，酶解物的抗氧化活性較好，酶解液對DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為52.24%和53.20%。

木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕，其酶解所得多肽液的抗氧化活性隨分子量的增大逐漸降低。

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