田懷香，徐曉琳，于海燕，陳 臣

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高活性益生菌酵素粉的制備及工藝優(yōu)化

田懷香，徐曉琳，于海燕，陳 臣※

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

為了提高酵素粉中益生菌的存活率以及產(chǎn)品的活性，該研究以植物乳桿菌1-33（Lp1-33）為發(fā)酵菌株，高密度培養(yǎng)后對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行噴霧干燥；通過內(nèi)源乳化法對(duì)菌體進(jìn)行微膠囊包埋，再對(duì)微膠囊進(jìn)行真空冷凍干燥，最后2部分產(chǎn)物經(jīng)混勻造粒制得益生菌酵素粉；以包埋率、胃腸道存活率、釋放率等為指標(biāo)，考察多重保護(hù)技術(shù)對(duì)其活性的保護(hù)效果。結(jié)果表明：采用內(nèi)源乳化法，乙二胺四乙酸鈣為鈣載體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%海藻酸鈉為壁材，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%殼聚糖-三聚磷酸鈉為涂層材料效果最佳；此條件下制備的微膠囊包埋率≥80%，經(jīng)模擬胃液處理2 h后其菌體存活率≥50%，模擬腸液處理2 h后釋放率≥90%；最佳冷凍保護(hù)劑配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%脫脂奶粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%乳糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%抗壞血酸鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%谷氨酸鈉，酵素粉與保護(hù)劑比例1:10；制備的酵素粉30 ℃保存3個(gè)月，活菌數(shù)仍≥9.5 lg(CFU/g)；與發(fā)酵前果汁相比，其清除自由基能力提高了近20%。通過上述多重活性保護(hù)技術(shù)，提高了菌體的存活率和抗逆境能力，獲得高密度、高活性的益生菌酵素粉，為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

益生菌；酵素粉；微膠囊；內(nèi)源乳化法；模擬胃腸試驗(yàn)；清除自由基能力

0 引 言

酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[1]。目前市場(chǎng)上酵素食品主要包括液體狀、膏狀、粉劑、片劑等形式。近年來，酵素粉憑借其易保存、易運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ慕退仄贩N[2]。然而目前市場(chǎng)產(chǎn)品存在“密度低、活性差”等問題制約著其發(fā)展，因而研發(fā)具有高益生菌含量、高活性成分的酵素粉已成為行業(yè)發(fā)展的重要趨勢(shì)之一[3]。

含有益生菌的產(chǎn)品在加工、存貯、運(yùn)輸中受到溫度、水分、壓力、氧氣等環(huán)境因素的脅迫[4]；在人體消化過程中受到膽鹽、胃酸等消化液的處理[5-6]，同時(shí)為了發(fā)揮其益生作用，還需要它可以到達(dá)腸道后定點(diǎn)釋放。為了實(shí)現(xiàn)該特點(diǎn)，許多保護(hù)技術(shù)被研究和利用。其中，微膠囊技術(shù)憑借粒徑小和對(duì)包埋物質(zhì)保護(hù)性好、釋放性佳等特點(diǎn)，成為重點(diǎn)研究的方向[7-8]。微膠囊的制備方法眾多，其中內(nèi)源乳化法操作容易，設(shè)備簡(jiǎn)單且克服了外源乳化法制備的微膠囊易簇集、易破裂、顆粒大小不均一等缺點(diǎn)[9]，已成為一種保護(hù)益生菌的主要方法。

目前，國(guó)內(nèi)外制備酵素粉的方法主要有：噴霧干燥、真空冷凍干燥等[10]。其中，噴霧干燥法成本低，效率高[11]，但是由于需要經(jīng)過高溫，菌體存活率較低，更適合熱敏性低的液體樣品[12]。目前市面上的部分粉狀酵素產(chǎn)品是經(jīng)噴霧干燥而成，產(chǎn)品中不含有或含有數(shù)量較低的活性益生菌，不能滿足益生菌產(chǎn)品對(duì)于活菌數(shù)的要求（106CFU/g或106CFU/mL）[13-14]。真空冷凍干燥法制得的產(chǎn)品活菌數(shù)量更多，活性喪失少，在運(yùn)輸存貯處理過程中更加簡(jiǎn)便，但其成本較高，不宜進(jìn)行大規(guī)模的液體處理[15-16]。根據(jù)酵素上清液和菌泥不同的干燥效果要求，可以將兩種干燥技術(shù)相結(jié)合[17]，降低生產(chǎn)成本的同時(shí)最大限度地保護(hù)發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性，從而得到真正意義上的高活性酵素粉。

本試驗(yàn)以水果等為原料，利用高密度培養(yǎng)技術(shù)富集微生物，通過將發(fā)酵上清液噴霧干燥、菌體微膠囊化包埋后再冷凍干燥等多重活性保護(hù)技術(shù)的應(yīng)用，最大限度地提高菌體的存活率、定點(diǎn)釋放能力和產(chǎn)品的活性，開發(fā)出一種具有高活性的酵素粉，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌1-33（1-33，Lp 1-33）篩選自四川泡菜，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 材料與試劑

MRS肉湯、MRS瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；海藻酸鈉（Alg）、殼聚糖（CS）、三聚磷酸鈉（TPP）、乙二胺四乙酸鈣（EDTA-Ca）、冰醋酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；果糖、大豆油，廣州鴻易食品添加劑有限公司；濃縮蘋果汁，夏縣田源果汁有限責(zé)任公司；抗壞血酸鈉，Biosharp試劑有限公司，食品級(jí)；乳糖、脫脂乳粉，恒天然商貿(mào)（上海）有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

WFJ 7200可見光分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；PT-MR 2100高速剪切乳化機(jī)，瑞士Kinematica公司；BLBIO-XM-5 L發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；FD-2冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；QZR.P-5高速離心噴霧干燥機(jī)，無錫市林洲干燥機(jī)廠。

1.4 方 法

1.4.1 工藝流程

以植物乳桿菌1-33為發(fā)酵菌株，進(jìn)行高密度培養(yǎng)（濃縮蘋果汁用蒸餾水1:6稀釋，加入2%果糖、體積比0.7%番茄汁，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至6.0，滅菌，冷卻，3%接種量接菌后，37 ℃恒溫培養(yǎng)至pH值4.4時(shí)停止發(fā)酵），離心（4 ℃、3 500 r/min、15 min）得到發(fā)酵上清液和菌泥；對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行噴霧干燥（采用常規(guī)工藝進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度140 ℃、出風(fēng)溫度80 ℃、進(jìn)樣量25 mL/min，高壓泵壓力12.5～15.0 MPa）制得發(fā)酵上清粉末；通過內(nèi)源乳化法對(duì)菌體進(jìn)行微膠囊包埋（乙二胺四乙酸鈣為鈣載體，1.5%海藻酸鈉為壁材，0.3%殼聚糖-三聚磷酸鈉為涂層材料），添加最佳冷凍保護(hù)劑后（10%脫脂奶粉、8%乳糖、1%抗壞血酸鈉、1%谷氨酸鈉，酵素粉與保護(hù)劑比例1:10），再對(duì)微膠囊進(jìn)行真空冷凍干燥（?80 ℃、0.02 MPa、24 h），最后2部分產(chǎn)物經(jīng)混勻造粒即制得益生菌酵素粉。

1.4.2 高密度培養(yǎng)

將植物乳桿菌1-33按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，活化2代；試驗(yàn)時(shí)，按1%接種于MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心（4 ℃、6 000 r/min、15 min），洗滌，收集菌體，重懸于無菌水中。高密度培養(yǎng)：濃縮蘋果汁用蒸餾水體積比1:6稀釋，加入2%果糖、體積比0.7%番茄汁，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至6.0，滅菌（110 ℃、101 kPa、5 min），冷卻。按照3%的接種量接入植物乳桿菌1-33菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)，選擇pH值4.4為發(fā)酵終點(diǎn)[18]。發(fā)酵完成后，將果汁離心（4 ℃、3 500 r/min、15 min），發(fā)酵上清液留用后續(xù)噴霧干燥，菌體重懸洗滌后進(jìn)行微膠囊包埋。

1.4.3 微膠囊制備工藝優(yōu)化

1）內(nèi)源乳化法制備微膠囊

內(nèi)源乳化法制備微膠囊，參照Poncelet等[9]和Zou等[19]的方法，稍作修改。制備過程如下：①乳化過程：制備一定濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、1.5%、3%、4.5%）的海藻酸鈉溶液分別與25 mmoL/L鈣鹽混合溶液，取20 mL配好的上述溶液與10 mL 1.4.2中所得菌懸液混合均勻，加入到含1% span80的70 mL大豆油中，機(jī)械攪拌（300 r/min、15 min）；②酸化過程：冰醋酸和EDTA-Ca的摩爾比為5，逐滴加入含有0.23 g冰醋酸的20 mL大豆油，機(jī)械攪拌（100 r/min、30 min）；③收集過程：加入200 mL含0.9% NaCl的磷酸鹽緩沖液（0.1 moL/L pH值7.0），靜置1～2 h，棄去油層，離心，洗滌，收集，即得到海藻酸鈉微膠囊（Alg-M）。

2）不同鈣載體對(duì)微膠囊性能的影響

分別選擇25 mmoL/L Ca-EDTA/CaCO3作為鈣載體進(jìn)行微膠囊的制備，方法參考1.4.3中的1），測(cè)定其粒徑和包埋率以比較不同鈣載體對(duì)微膠囊性能的影響。

3）不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊性能的影響

分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、1.5%、3%、4.5%海藻酸鈉進(jìn)行微膠囊的制備，方法參考1.4.3中的1），測(cè)定其粒徑和包埋率以比較不同海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊性能的影響。

1.4.4 微膠囊粒徑和包埋率的測(cè)定

激光粒度分析儀測(cè)定：參照Krasaekoopt等[20]的方法。微膠囊的包埋率（microencapsulation efficiency, ME）通過平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，參考Annan等[21]的方法。包埋率的計(jì)算公式為：ME=/0×100%，其中是指包埋于微膠囊中的活菌數(shù)；0是指初始的活菌數(shù)。

1.4.5 強(qiáng)化植物乳桿菌微膠囊的制備

植物乳桿菌微膠囊單因素優(yōu)化試驗(yàn)顯示EDTA-Ca為鈣源，海藻酸鈉濃度為1.5%時(shí)，制備的海藻酸鈉微膠囊粒徑和包埋效果最佳。但其在模擬胃液中的存活率120 min即完全失活，達(dá)不到益生菌產(chǎn)品活菌數(shù)量的要求。需對(duì)其進(jìn)行二次包衣強(qiáng)化處理，以提高其對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)效果。

1）制備海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊（Alg-CS-M）

參照鄒強(qiáng)等[22]的方法，稍作修改：將10 g包埋有植物乳桿菌的海藻酸鈉微膠囊加入到50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%殼聚糖溶液（pH值 3.0）中，緩慢攪拌10 min，過濾收集微膠囊，洗滌，離心，即得到海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊（Alg-CS-M）。

2）制備海藻酸鈉-殼聚糖-三聚磷酸鈉微膠囊（Alg-CS-TPP- M）

將0.3 g的三聚磷酸鈉溶于100 mL蒸餾水中，并加入到包埋有植物乳桿菌的海藻酸鈉微膠囊溶液中，其余同1.4.5中的1），制成海藻酸鈉-殼聚糖-三聚磷酸鈉微膠囊（Alg-CS-TPP- M）。

1.4.6 不同微膠囊對(duì)益生菌在模擬胃腸道中的存活和釋放效果

1）經(jīng)微膠囊包埋的植物乳桿菌在模擬胃液中的存活試驗(yàn)

將1.0 mL菌液或者1.0 g包埋有植物乳桿菌的兩種微膠囊（Alg-CS-M 和Alg-CS-TPP- M）浸泡在9.0 mL 模擬胃液（simulated gastric juice, SGJ）[23-24]中，分別在30，60，90和120 min時(shí)取樣，剪切破碎（10 000 r/min, 45 s），進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式如下：

存活率=/×100% （1）

式中為人工胃液處理后1 g或1 mL樣品中的活菌數(shù)，CFU/g；為人工胃液處理前1 g或1 mL 樣品中的活菌數(shù)，CFU/g。

2）經(jīng)微膠囊包埋的植物乳桿菌在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)

將1.0 g包埋有植物乳桿菌的上述2種微膠囊浸泡在9.0 mL模擬腸液（simulated intestinal juice, SIJ）[25]中，分別在30、60、90和120 min時(shí)取樣，進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式如下

釋放率=/×100% （2）

式中為人工腸液處理后1 g微膠囊中的活菌總數(shù)，CFU/g；為人工腸液處理前1 g微膠囊中的活菌總數(shù)，CFU/g。

1.4.7 冷凍干燥保護(hù)劑的優(yōu)化試驗(yàn)

1）單因素試驗(yàn)

①最適脫脂乳粉、乳糖、抗壞血酸鈉、谷氨酸鈉添加量

將菌泥分別與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳粉（8%、10%、12%）、乳糖（8%、10%、12%）、抗壞血酸鈉（1%、1.5%、2%）和谷氨酸鈉（1%、1.5%、2%）凍干保護(hù)劑混合均勻，倒入平板中（厚度約5 mm），冷凍干燥（?80 ℃、0.02 MPa、24 h，下同），將所得菌粉稀釋，測(cè)定其中的活菌數(shù)。

②最適混合比

將菌泥與凍干保護(hù)劑混合，質(zhì)量混合比例分別為1:5、1:10、1:15，測(cè)定其中的活菌數(shù)。

2）復(fù)配試驗(yàn)

選用脫脂乳粉（質(zhì)量比8%、10%、12%）和最適質(zhì)量混合比（1:5、1:10、1:15）作為復(fù)配試驗(yàn)的因素，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得最佳配方。

1.4.8 酵素粉的小試生產(chǎn)及性質(zhì)測(cè)定

1）酵素粉的小試生產(chǎn)

植物乳桿菌1-33菌種活化后，按3%接種于5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵液體積3.5 L，37 ℃保溫發(fā)酵至pH值為4.4。離心后，所得發(fā)酵上清液經(jīng)噴霧干燥（采用常規(guī)工藝進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度140 ℃、出風(fēng)溫度80 ℃、進(jìn)樣量25 mL/min，高壓泵壓力控制12.5～15.0 MPa，助干劑為料液質(zhì)量20%的麥芽糊精）制得發(fā)酵上清粉末；所得的菌體經(jīng)上述最優(yōu)方案進(jìn)行包埋后，添加最優(yōu)冷凍保護(hù)劑，冷凍干燥（?80 ℃、0.02 MPa、24 h）后制得凍干菌粉。2部分粉劑經(jīng)混勻，造粒，即得到益生菌酵素粉。

2）DPPH自由基清除試驗(yàn)

參照Brand-Williams等[26-27]建立的DPPH自由基清除試驗(yàn)方法，將酵素粉與蒸餾水質(zhì)量1:7比例復(fù)溶后，測(cè)定其自由基清除能力。以未發(fā)酵的蘋果汁（蘋果濃縮汁與蒸餾水1:6稀釋）作為對(duì)照，結(jié)果以Vc當(dāng)量表示。

3）耐儲(chǔ)藏性試驗(yàn)

按照上述試驗(yàn)方法發(fā)酵所得酵素粉30 ℃溫度下貯存3個(gè)月，模擬室溫下12個(gè)月的保質(zhì)期。每隔1個(gè)月取樣，酵素粉與蒸餾水質(zhì)量1:7比例復(fù)溶后剪切，測(cè)定植物乳桿菌1-33的活菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壁材對(duì)微膠囊的粒徑及包埋率的影響

2.1.1 不同鈣載體對(duì)微膠囊的粒徑及包埋率的影響

由表1可知，與CaCO3海藻酸鈉微膠囊相比，EDTA-Ca海藻酸鈉微膠囊的平均粒徑為138m，明顯小于CaCO3海藻酸鈉微膠囊的平均粒徑。Lawless等[28]的研究表明：用于加入食品中微膠囊大小應(yīng)該在100～200m之間，故EDTA-Ca海藻酸鈉微膠囊的平均粒徑更符合食品中微膠囊粒徑大小的要求?？缍认禂?shù)代表微球的分散性，與CaCO3海藻酸鈉微膠囊相比，EDTA-Ca海藻酸鈉微膠囊的跨度系數(shù)較小，表明其均一性更好。此外，EDTA-Ca海藻酸鈉微膠囊對(duì)菌體的包埋率也顯著高于CaCO3海藻酸鈉微膠囊。綜上，EDTA-Ca更適合作為內(nèi)源乳化法制備海藻酸鈉微膠囊的鈣載體，這可能是因?yàn)镃aCO3的水溶性較差，其懸浮液可能會(huì)影響乳化過程，導(dǎo)致粒徑較大[29]。

表1 CaCO3海藻酸鈉微膠囊和EDTA-Ca海藻酸鈉微膠囊的平均粒徑、跨度系數(shù)和包埋率

2.1.2 不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊粒徑及包埋率的影響

由表2可知隨著海藻酸鈉濃度由1.0%增加到4.5%，微膠囊的平均粒徑由119增加到429m，跨度系數(shù)由0.83增加到2.65；微膠囊的包埋率由35.48%增加到83.61%又逐漸降低到45.64%。綜合考慮各因素，1.5%海藻酸鈉的微膠囊的包埋效果最佳。這可能是由于海藻酸鈉的濃度增加后，其黏度也隨之增大，導(dǎo)致乳化效率降低[18, 30-32]。因而選擇濃度為1.5%的海藻酸鈉作為壁材。

表2 不同Alg質(zhì)量分?jǐn)?shù)微膠囊的平均粒徑、跨度系數(shù)和包埋率

2.2 不同微膠囊對(duì)益生菌在模擬胃腸道中存活和釋放的影響

2.2.1 對(duì)植物乳桿菌1-33在模擬胃液中存活率的影響

由圖1可知未微膠囊化菌體在SGJ中的存活率非常低，在模擬胃液中經(jīng)過30 min后，其存活率僅為60.4%，且隨著時(shí)間推移快速下降，120 min時(shí)，活菌幾乎全部被殺死，表明其無法再以活性益生菌的形態(tài)進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。而Alg-CS-M和Alg-CS-TPP-M微膠囊中的菌體在SGJ (simulated gastric juice) 中的存活率均大大提高，在SGJ中浸沒30 min后，其存活率分別為86.5%和92.7%，比未包埋菌體的存活率提高了26.1%和32.3%。與Alg-CS-M微膠囊相比，隨著在SGJ中的時(shí)間延長(zhǎng)，Alg-CS-TPP-M微膠囊中菌體存活率下降趨勢(shì)更為遲緩。相關(guān)研究表明：酸性條件下，殼聚糖的氨基電離產(chǎn)生的NH3+與TPP中的磷酸負(fù)電離子依靠靜電吸力可形成緊湊的聚電解質(zhì)復(fù)合體，形成更加致密的保護(hù)膜涂層[24,33]，故其對(duì)菌體的保護(hù)效果更佳。

圖1 不同微膠囊Lp1-33在模擬胃液中隨著時(shí)間變化的存活率

2.2.2 對(duì)植物乳桿菌1-33在模擬腸液中釋放率的影響

由圖2可知，經(jīng)Alg-CS-TPP-M微膠囊包埋的菌體在剛進(jìn)入SIJ時(shí)釋放比較緩慢，30 min時(shí)其釋放率僅為經(jīng)聚合物包衣的Alg-CS-M微膠囊的一半，但隨著時(shí)間的推移，其釋放效果逐漸提高；60~90 min期間，兩者的釋放率均明顯增加；120 min時(shí)，兩者的釋放率均超過了90%，基本完全釋放。但整體而言，Alg-CS-TPP-M微膠囊在SIJ中的釋放率始終低于Alg-CS-M微膠囊的釋放率。這可能由于殼聚糖與三聚磷酸鈉之間存在物理交聯(lián)作用，形成了更加致密的結(jié)構(gòu)[24,33]，從而導(dǎo)致釋放率略低。

2.3 凍干保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)Lp1-33冷凍干燥存活率的影響

2.3.1 單因素試驗(yàn)對(duì)Lp1-33冷凍干燥存活率的影響

由表3可知，脫脂奶粉添加量對(duì)最后的菌粉中的植物乳桿菌Lp1-33存活率有明顯的影響，當(dāng)其他物質(zhì)添加量相同時(shí)，10%脫脂奶粉的保護(hù)劑具有更強(qiáng)的保護(hù)作用；當(dāng)其他物質(zhì)添加量相同，添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖、抗壞血酸鈉、谷氨酸鈉，數(shù)值不存在明顯差異；當(dāng)菌泥與凍干保護(hù)劑混合比例為1:10時(shí)，活菌數(shù)為10.9 lg(CFU/g)，此時(shí)的保護(hù)劑具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

圖2 不同微膠囊在模擬胰液中隨著時(shí)間變化的釋放率

表3 不同保護(hù)劑組份的添加量及比例對(duì)Lp1-33冷凍干燥存活率的影響

2.3.2 凍干保護(hù)劑復(fù)配試驗(yàn)對(duì)Lp1-33冷凍干燥存活率的影響

鑒于乳糖、抗壞血酸鈉、谷氨酸鈉對(duì)冷凍干燥保護(hù)效果影響不大，故在復(fù)配試驗(yàn)中，按照8%乳糖、1%抗壞血酸鈉、1%谷氨酸鈉進(jìn)行試驗(yàn)。采用脫脂乳粉添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、10%、12%）和菌泥與凍干保護(hù)劑混合比（1:5、1:10、1:15）為因素，進(jìn)行比較。如表4所示，當(dāng)選用10%脫脂乳粉，且混合比為1:10時(shí)，菌粉中菌體濃度最高達(dá)11.63 lg(CFU/g)，此時(shí)凍干保護(hù)劑對(duì)菌體的保護(hù)效果最佳。

表4 復(fù)配試驗(yàn)對(duì)Lp1-33冷凍干燥存活率的影響

2.4 酵素粉的小試生產(chǎn)及清除自由基能力和耐貯存性研究

2.4.1 小試生產(chǎn)酵素粉的相關(guān)指標(biāo)

利用實(shí)驗(yàn)室的小型設(shè)備，按照上述探索的試驗(yàn)條件，進(jìn)行酵素粉的小試生產(chǎn)。采用小型發(fā)酵罐進(jìn)行酵素發(fā)酵，發(fā)酵液體積3.5 L，發(fā)酵時(shí)間約40 h，菌體濃度約為4.4×109CFU/mL。離心后，上清液經(jīng)噴霧干燥，得到850 g干粉，收粉率為74.5%。菌體經(jīng)包埋后，最終制得約380 g微膠囊，微膠囊的包埋率達(dá)82.3%，模擬胃液存活率2 h后為63.7%，經(jīng)人工腸液處理后釋放率達(dá)88.3%。兩者均勻混合得約1.2 kg的酵素粉，微膠囊酵素粉中的活菌數(shù)為11.5 lg(CFU/g)。

2.4.2 DPPH清除自由基活力

由表5可以看出，經(jīng)上述處理所得的酵素粉與未發(fā)酵的蘋果汁相比，其清除自由基能力的指標(biāo)提高了近20%。這表明水果等經(jīng)過發(fā)酵，對(duì)DPPH自由基的清除能力有一定提高，這可能與益生菌菌體自身或益生菌促進(jìn)果汁發(fā)酵后產(chǎn)生更多的生物活性物質(zhì)有關(guān)。根據(jù)Kwaw等[34]的研究，經(jīng)過微生物發(fā)酵，會(huì)產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，例如有機(jī)酸、多酚等，這些物質(zhì)可作為氫離子供體起到抗氧化作用。此外，益生菌自身也具有一定的抗氧化能力，發(fā)酵后期，會(huì)有部分菌體自溶，胞內(nèi)物質(zhì)溶出，從而起到清除自由基和抗氧化效果[35]。

表5 不同樣品的Vc當(dāng)量值

2.4.3 耐儲(chǔ)存性試驗(yàn)

通過30 ℃溫度下貯存3個(gè)月模擬室溫下12個(gè)月的保質(zhì)期，并監(jiān)測(cè)微膠囊中植物乳桿菌1-33活菌數(shù)量的變化。由圖3可知，在保質(zhì)期內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)其活菌數(shù)量逐漸降低，但菌密度仍≥9.5 lg(CFU/g)。該結(jié)果與田文靜等的研究結(jié)果類似[36]，說明所制得的活性酵素粉在保質(zhì)期內(nèi)無需冷藏保存仍具有良好的耐貯存性能。

圖3 儲(chǔ)存期間微膠囊中植物乳桿菌1-33的活菌數(shù)的變化

3 結(jié) 論

本課題根據(jù)酵素上清液和菌體的不同特點(diǎn)，分別采用噴霧干燥、微膠囊包埋技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)等多重保護(hù)技術(shù)制備新型益生菌酵素粉。采用內(nèi)源乳化法，EDTA-Ca為鈣載體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%海藻酸鈉為壁材，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%殼聚糖- 三聚磷酸鈉為涂層材料，能有效保護(hù)植物乳桿菌免受胃酸損害，同時(shí)增加其在腸道中的定向釋放。通過微膠囊的包埋和冷凍保護(hù)劑的優(yōu)化，提高了益生菌酵素粉的活菌數(shù)量，所得酵素粉不需冷藏保存，保質(zhì)期內(nèi)的活菌數(shù)仍≥9.5 lg(CFU/g)。同時(shí)，與發(fā)酵前果汁相比，其清除自由基能力提高了近20%。綜上所述，本研究通過多重保護(hù)技術(shù)開發(fā)了兼具有酵素發(fā)酵上清活力和益生菌活力的高活性酵素粉，并通過生產(chǎn)放大的小試生產(chǎn)試驗(yàn)，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論技術(shù)支持。

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Preparation and technology optimization of high activity Jiaosu powder with probiotics

Tian Huaixiang, Xu Xiaolin, Yu Haiyan, Chen Chen※

(,,201418,)

In recent years, Jiaosu products on the market mainly include liquid, paste, powder, tablet and other product forms. Among them, Jiaosu powder with probiotics has become the promising variety of Jiaosu serial products due to its feature of easy preservation and friendly transportation. However, there are some issues with the existing product such as low density and activity, these issues restrict its development. Thus, Jiaosu powder containing probiotics with high density and activity has become one of the notable trends. In order to improve the viability of probiotics in Jiaosu powder and the activity of the product, preparation and optimization of high activity Jiaosu powder with probiotics and the bio-activity of the products was investigated in this study.1-33 (Lp1-33) was used as the microbial starter culture. Firstly, high density cultivation was used for bacteria enrichment. and the fermentation broth was centrifuged to obtain the cell free supernatant and bacteria pellets. According to the different requirements of the drying effects of the supernatant and bacteria, this study combined two drying technique to reduce the cost and and maximize the protection effects. The cell free supernatant was treated by spray drying. The bacteria pelletswere microencapsulated by endogenous emulsification with optimized calcium carriers and appropriate sodium alginate concentration and coating with chitosan to provide extra protection for the strain. Then the microcapsules were treated by vacuum freeze drying. Finally, the two products were mixed and pelleted as granules to form the Jiaosu powder. The microencapsulation efficiency (ME), gastrointestinal survival rate and release rate were used as indicators to investigate the protective effect of multiple protection techniques on biological activity. The results showed the endogenous emulsification was an effective method for microcapsulation using EDTA-Ca as the calcium carrier, 1.5% sodium alginate as the wall material, and 0.3% chitosan-sodium tripolyphosphate as the coating material. Under these conditions, the microencapsulation efficiency of prepared microcapsule was more than 80%; After treatment with artificial simulated gastric juice (SGJ) and simulated intestinal juice (SIJ) for 2 h, the survival rate of1-33 was more than 50%, and the release rate was greater than 90%. These results indicated large amounts of viable cells ofwere obtained after acid stress of gastric juice and could be directional released in the intestinal tract. According to single factor and orthogonal experiment, the best formula of cryoprotectants was: 10% skim milk powder, 8% lactose, 1% sodium ascorbate, 1% sodium glutamate and the ratio of bacterial powder to cryoprotectant is 1:10. Then the prepared probiotics Jiaosu powder was stored at 30 ℃ for 3 months, and the amount of1-33 is still more than 9.5 lg(CFU/g); Compared with the pre-fermentation juice, free-radical scavenging activity of probiotics Jiaosu powder increased by nearly 20%. Through the above multiple active protection techniques, the survival rate and stress tolerance of bacteria are improved, and a new kind of probiotics Jiaosu powder with high density and high activity is obtained, which provides technical support for the subsequent industrial production.

probiotics; probiotics Jiaosu powder; microcapsule; endogenous emulsification; simulated gastric-intestinal juice experiment; free-radical scavenging activity

2019-01-14

2019-5-16

上海市科技啟明星計(jì)劃（17QB1404200）；上海市曙光計(jì)劃（16SG50）

田懷香，博士，教授，研究方向?yàn)槭称凤L(fēng)味化學(xué)。Email：tianhx@sit.edu.cn

陳 臣，博士，副教授，研究食品微生物學(xué)。Email：chenchen@sit.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.038

TS201.3

A

1002-6819(2019)-11-0330-07

田懷香，徐曉琳，于海燕，陳 臣. 高活性益生菌酵素粉的制備及工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(11)：330－336. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.038 http://www.tcsae.org

Tian Huaixiang, Xu Xiaolin, Yu Haiyan, Chen Chen. Preparation and technology optimization of high activity Jiaosu powder with probiotics[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(11): 330－336. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.038 http://www.tcsae.org