吳佳源 劉俊

神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)、誘導定向分化及其在臨床上的應用已成為21世紀的一個研究熱點。感音神經(jīng)性聾是耳鼻咽喉科常見病之一，該病嚴重影響患者的聽覺功能及生活質(zhì)量。目前幫助中重度聽力損失患者提高聽力的唯一方法是使用人工耳蝸或助聽器去直接刺激聽神經(jīng)，但這都受限于復雜的聽力損傷機制和組織損傷程度[1]。耳蝸毛細胞的變性、壞死是導致永久性感音神經(jīng)性聾的主要原因[2]，在哺乳動物中，毛細胞一旦死亡便不會再生[3]。如果能讓耳蝸毛細胞再生變成可能，那么這將會給耳聾的治療帶來重大突破。內(nèi)耳毛細胞的再生由其前體細胞分裂、分化而來，毛細胞的前體細胞有以下幾種來源[4]: ①耳蝸感覺上皮內(nèi)的支持細胞：支持細胞分裂、增殖、分化為毛細胞；或者直接形態(tài)轉(zhuǎn)化為毛細胞；②受損區(qū)周圍的毛細胞，如亞急性損傷毛細胞的自我修復；③基底乳頭周圍的非感覺性上皮細胞分化；④聽覺上皮耳蝸多能干細胞的分化；⑤神經(jīng)干細胞的分化?？梢?，通過神經(jīng)干細胞移植有可能再生耳蝸內(nèi)的毛細胞，為感音神經(jīng)性聾患者帶來康復希望。因此，本研究以SD孕鼠的胎鼠海馬組織為原材料來分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，擬為后續(xù)干細胞移植實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 孕14～15 d的SD大鼠3只，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2神經(jīng)干細胞培養(yǎng)主要試劑 標準胎牛血清、青-鏈霉素溶液(濃度為100 IU/ml)購于上海生工生物工程有限公司;EGF(20 μg)、bFGF(10 μg)購于Peprotech公司;B27添加劑(50×)購于Thermo Fisher公司；DEME/F12(1∶1)、TrypLTM Express(1×)購于Gibco公司;

1.1.3神經(jīng)干細胞鑒定的主要試劑 鼠抗NSE(1∶100)多克隆抗體，鼠抗GFAP多克隆抗體(1∶100)，Brdu、鼠抗Brdu單克隆抗體(1∶100)，兔抗Nestin多克隆抗體(1∶100)，Cy3標記的羊抗鼠二抗(1∶100)，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔二抗(1∶100)均購自武漢博士德公司。

1.1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(奧林巴斯)，熒光顯微鏡(日本蔡司)，血細胞計數(shù)板(上海求精)。

1.2神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法

1.2.1神經(jīng)干細胞無血清培養(yǎng)液的配制 取DMEM/F12(1∶1)100 ml，加入EGF(20 ng/ml)、bFGF(20 ng/ml)、B27添加劑(2%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青-鏈霉素溶液1 ml(濃度為100 IU/ml)。配好后4 ℃保存。培養(yǎng)基應保持新鮮，一般一次配制100 ml并在1周內(nèi)用完。

1.2.2血清培養(yǎng)基的配制 DMEM/F12(1∶1):90%、胎牛血清：10%。4 ℃保存。

1.2.3神經(jīng)干細胞提取 取孕14～15 d SD大鼠，用戊巴比妥進行腹腔麻醉，放置于 75% 醫(yī)用酒精中完全浸泡消毒 5 min，轉(zhuǎn)移至無菌間; 剪開孕鼠腹腔，暴露并取出子宮，放入培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)入超凈工作臺;除去子宮和胎膜，仔細分離出胎鼠海馬，用常溫PBS漂2次，盡量將腦膜剝除干凈。用眼科剪將腦組織剪成細小碎塊，然后將其移到10 ml離心管中(一個腦組織配一支試管)。離心(1 000 r/min，2 min)后丟棄上清液，在試管中加入2倍腦組織體積的TrypLTM Express(1×)，在37 ℃水浴下輕柔振蕩5 min，加入DEME/F12(1∶1)至試管刻度5 ml，用吸管輕柔吹打，經(jīng)200×細胞篩過濾，離心(1 000 r/min，5 min)丟棄上清液。再用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，輕柔吹打數(shù)次以形成單細胞懸液。以密度1×106ml-1(臺盼蘭計數(shù)細胞密度，不計死亡細胞)接種于25 cm2的透氣培養(yǎng)瓶中然后置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 在倒置顯微鏡下觀察并記錄培養(yǎng)細胞的狀況，如培養(yǎng)液的顏色、雜質(zhì)情況，培養(yǎng)細胞的密度、折光度以及神經(jīng)球形成大小、折光度等。然后根據(jù)情況隔1～2 d離心(1 000 r/min，5 min)后半量換液，再視神經(jīng)球生長大小情況進行傳代，一般4天左右傳代，傳代時全部換液。為了解神經(jīng)干細胞的增殖狀態(tài)，待培養(yǎng)3～4代后對每代的神經(jīng)球個數(shù)及直徑進行測量。采用美國圖像處理軟件(image processing plus system 6.0)檢測神經(jīng)球個數(shù)，每樣本隨機選擇12個神經(jīng)球測量平均直徑。

1.3神經(jīng)干細胞鑒定方法

1.3.1NSCs的Nestin免疫組化熒光鑒定 將傳至第3代且培養(yǎng)成神經(jīng)球的神經(jīng)干細胞置入裝有0.1%多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的24孔板中,然后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，過夜后收獲貼壁細胞，用FITC標記免疫熒光法檢測巢蛋白(nestin)的表達。方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；4%的多聚甲醛固定20 min；丟棄固定液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；用0.25%TritonX-100破膜10分鐘；丟棄破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；用5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原(封閉液蓋過蓋破片即可),室溫孵育30分鐘，丟棄封閉液，盡量吸干殘液,不用PBS洗；滴加1∶100稀釋度的兔抗nestin多克隆抗體(一抗),4 ℃濕盒孵育過夜；丟棄一抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；滴加FITC標記的羊抗兔二抗(1∶100)，室溫孵育1小時；丟棄二抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；挑起蓋玻片后，貼有細胞的一面向下蓋上已加入抗熒光猝滅劑的載玻片(注意不要產(chǎn)生氣泡)；在熒光顯微鏡下觀察、照相并記錄。

1.3.2Brdu摻入試驗 培養(yǎng)的第3代神經(jīng)干細胞懸液行Brdu標記。在機械分離傳代時，按6 μg/ml(20 μmol/L)的濃度在NSCs懸液加入Brdu。按1.3.1的方法進行處理并收獲細胞，用Nesein與Brdu免疫熒光雙標技術(shù)鑒定，方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；用90%乙醇/1%冰乙酸固定10分鐘；用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘夜；用0.25%TritonX-100破膜10分鐘；丟棄破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；0.4%胃酶消化室溫20分鐘；2N鹽酸室溫處理30分鐘；丟棄鹽酸，吸干殘液，硼砂(0.1 mol/L)室溫中和10分鐘；丟棄硼砂，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原,室溫孵育30分鐘；丟棄封閉液，吸干殘液，不用PBS洗，加入鼠抗BrdU和兔抗Nestin一抗混合液,4 ℃濕盒反應36 h；丟棄一抗混合液，用1XPBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；滴加FITC標記的羊抗兔和Cy3標記的羊抗鼠的二抗混合液,室溫孵育3 h。丟棄二抗混合液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；挑起蓋玻片后，貼有細胞的一面向下蓋上已加入抗熒光猝滅劑的載玻片(注意不要產(chǎn)生氣泡)；在免疫熒光顯微鏡下觀察、照相并記錄。

1.3.3熒光染料Hoechest33342標記神經(jīng)干細胞 培養(yǎng)的第3代NSCs懸液離心800 r/5 min,離去上清液，細胞沉淀重新加入無血清培養(yǎng)基，機械吹打均勻后加入用1×PBS溶解Hoechst33342,終濃度為10 μg/ml,37 ℃，反應2 h,將標記細胞離心沉淀并用新鮮培養(yǎng)液清洗2次，每次離心5 min,并反復吹打使其變成單細胞，在熒光顯微鏡下查看細胞核標記情況。

1.3.4誘導分化NSCs及其鑒定 將經(jīng)熒光染料標記后的NSCs按1.3.1的方法進行培養(yǎng)并收獲細胞，用FITC標記免疫熒光法檢測巢蛋白(Nestin)的表達，同時觀察其細胞核中熒光染料標記后的藍色熒光的表達。NSCs 的誘導分化：將培養(yǎng)的、經(jīng)熒光燃料標記的第2代NSCs反復吹打，制成單細胞懸液，置入裝有0.1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的24孔板中,培養(yǎng)條件為: 血清培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2,每 2～3 d換液一次，每天在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，4～5 d后可收獲分化細胞。用Cy3標記免疫熒光法檢測分化后細胞的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，星狀膠質(zhì)細胞特異性表達的胞漿蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原2，3-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP)，同時觀察其細胞核中熒光染料標記后的藍色熒光的表達。Cy3 標記免疫熒光法方法同1.3.1(步驟分別滴加1∶100稀釋度鼠抗GFAP多克隆抗體、鼠抗CNP多克隆抗體及鼠抗NSE多克隆抗體,4 ℃孵育過夜)。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)結(jié)果 由孕14～15 d的胎鼠海馬組織分離、培養(yǎng)的細胞, 初代培養(yǎng)時細胞以橢圓形為主，表面可見絨毛，細胞折光性強，呈懸浮生長。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細胞呈球形增長,生長速度快、活性好(圖1)。在培養(yǎng)過程中，隨著細胞球體積的不斷增大，部分細胞球可融合，有的細胞球中央部分由于缺少營養(yǎng)，而出現(xiàn)“老化”，透光性變差(圖2)。本實驗培養(yǎng)的細胞經(jīng)傳8代以上仍可繼續(xù)增殖生長，活性好。第4～9代神經(jīng)干細胞球的數(shù)量和直徑見表1。

表1 第4～9代神經(jīng)干細胞球的數(shù)量(個)和直徑

2.2大鼠神經(jīng)干細胞的鑒定結(jié)果

經(jīng)行Brdu 與 Nestin 的免疫熒光雙標染色，可見神經(jīng)干細胞球Brdu 與 Nestin 均為陽性(圖3a、b)。

用Hoechst33342熒光染料標記神經(jīng)干細胞后用FITC標記免疫熒光法檢測巢蛋白(Nestin)的表達，同時觀察其細胞核中熒光染料標記后的藍色熒光的表達(4a、b)。

熒光染料標記后的神經(jīng)干細胞經(jīng)含10%的胎牛血清(不含生長因子)的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導分化后,細胞團2～4 h開始貼壁,貼壁的細胞分化,并由NSCs團發(fā)出呈放射狀生長的細胞(圖5、6)。

用Cy3標記免疫熒光法檢測分化后細胞的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原(CNP)的表達，同時觀察其細胞核中熒光染料標記后的藍色熒光的表達(圖7～9)。

3 討論

神經(jīng)干細胞可以從發(fā)育中的大腦區(qū)域中分離獲得，包括大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和嗅覺上皮[5，6]，其具有自我更新能力和多能性。移植的神經(jīng)干細胞被證明可以遷移到腦損傷部位并分化成原生的細胞類型，如少突膠質(zhì)細胞[7]、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、皮質(zhì)神經(jīng)元[8]和脊髓神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元[9]，表明神經(jīng)干細胞既能替換損壞的神經(jīng)組織，又能恢復損傷后的功能。

被植入的神經(jīng)干細胞在形態(tài)學和蛋白質(zhì)表達上的不同取決于它們在耳蝸內(nèi)所處的位置，這表明耳蝸內(nèi)的微環(huán)境對神經(jīng)干細胞的發(fā)展起到重要的作用。可以假設(shè)，一旦這個神經(jīng)干細胞系遷移到耳蝸內(nèi)，接受到來自微環(huán)境的信號后，這些細胞便表達由內(nèi)耳細胞表達的細胞基因命運程序，并對該程序進行正反饋和負反饋調(diào)節(jié)以達到平衡。這同時也說明成年的哺乳動物耳蝸內(nèi)還保留著一些信號，這些信號對于干細胞沿著耳蝸的表型分化是很有必要的，盡管這些信號并不能作用于內(nèi)耳的細胞群使它們再生為毛細胞[10]?？梢?，通過神經(jīng)干細胞移植有可能再生耳蝸毛細胞，從而為感音神經(jīng)性聾患者的康復帶來希望。

圖1 SD大鼠NSCs球(×200) 圖2 “老化”的NSCs球(×200) 圖3 a.NSCs球Nestin陽性,FITC標記成綠色熒光(熒光顯微鏡×200);b.同一視野下細胞核Brdu陽性,Cy3標記成紅色熒光(熒光顯微鏡×200) 圖4 a.熒光染料標記后NSCs呈Nestin陽性,FITC標記成綠色熒光(熒光顯微鏡×200);b.同一視野下細胞核Hoechst熒光染料呈藍色熒光(熒光顯微鏡×200) 圖5 貼壁的神經(jīng)細胞球 圖6 貼壁分化的神經(jīng)干細胞 圖7 a.Cy3標記星形膠質(zhì)細胞特異性蛋白GFAP(紅色熒光);b.同一視野下細胞核Hoechst熒光染料呈藍色熒光 圖8 a.Cy3標記神經(jīng)元特異性蛋白NSE(紅色熒光);b.同一視野下細胞核Hoechst熒光染料呈藍色熒光 圖9 a.Cy3少突膠質(zhì)細胞特異性抗原CNP(紅色熒光);b.同一視野下細胞核Hoechst熒光染料呈藍色熒光

研究顯示，培養(yǎng)基中添加 bFGF 和 EGF 2種神經(jīng)干細胞培養(yǎng)常用的絲裂原，二者聯(lián)合使用能夠在短時期內(nèi)培養(yǎng)出大量神經(jīng)干細胞[11]；添加B27( 不含維生素 A) ，可避免神經(jīng)干細胞在增殖過程中出現(xiàn)分化現(xiàn)象和維持細胞的懸浮狀態(tài)[12]。本實驗從孕14～15 d SD大鼠的胎鼠腦海馬組織分離培養(yǎng)得來的細胞,采用無血清培養(yǎng)技術(shù)進行懸浮培養(yǎng),結(jié)果細胞具有很強的分裂、增殖及自我更新能力。

細胞培養(yǎng)過程中，細胞傳代時能否將神經(jīng)球吹打成單細胞懸液至關(guān)重要，神經(jīng)球中的神經(jīng)干細胞通過細胞骨架蛋白、特異的鈣連蛋白等形成黏附連接，單純依靠機械吹打很難將神經(jīng)球打散，若不能打散，則會極大影響下一代細胞的數(shù)量。目前，細胞傳代時主要使用的是胰酶消化法，但是胰酶的消化作用容易造成神經(jīng)干細胞的化學性損傷，而使用血清或酶抑制劑對抗胰酶的消化作用，也可能會降低神經(jīng)干細胞的活力和增殖率，從而影響實驗結(jié)果。故本實驗使用熱穩(wěn)定性更強、細胞毒性更低、作用更溫和的TrypLTM Express，其和胰酶有相同的作用位點，是一種高純度的重組酶，不需要用血清或酶抑制劑對抗其消化作用。本實驗中，先將細胞用TrypLTM Express在37 ℃下作用5 min，然后用3 ml的吸管輕柔吹打，可以比較容易地獲得單細胞懸液。吹打過程中動作要輕柔，勿用力過猛，否則容易損傷細胞。傳代的時機對能否獲取高質(zhì)量的單細胞懸液也很重要，如果傳代時神經(jīng)球體積過大，則細胞間的細胞連接非常緊密，神經(jīng)球很難被吹散，若強行分離，則會導致神經(jīng)干細胞破壞、溶解、死亡以及貼壁分化；如果傳代時神經(jīng)球體積過小，雖然比較容易將神經(jīng)球吹散，但獲得的神經(jīng)干細胞的數(shù)量偏少。本實驗一般在培養(yǎng)4～5天后傳代，但具體要視細胞球的生長速度。

Nestin是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞的主要骨架蛋白，也稱為巢蛋白，是神經(jīng)干細胞的主要鑒定指標之一。由于Nestin還存在于其它細胞，如某些腫瘤細胞及胰腺祖細胞等，故對于神經(jīng)干細胞的鑒定還要看它是否可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及能否分裂增殖，只有滿足上述條件的細胞才算是神經(jīng)干細胞[13]。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的特異性標志物分別為特異性烯醇化酶(NSE)、胞漿蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、2，3-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP)。神經(jīng)干細胞在胎牛血清作用下，可分化為NSE表達陽性的神經(jīng)元樣細胞、GFAP表達陽性的星形膠質(zhì)細胞及CNP表達陽性的少突膠質(zhì)細胞，說明培養(yǎng)出的NSCs具有多向分化能力。BrdU作為胸腺嘧啶的衍生物，常用來標記活細胞中合成的DNA，可穩(wěn)定復制到子代細胞中，從而可用于檢測細胞的增殖能力。本實驗中經(jīng)傳培養(yǎng)代3次的神經(jīng)干細胞，Nestin和BrdU均表達陽性。Hoechst是雙間二氮茚類物資，為特異性的DNA染料，對細胞無毒，可以對細胞核著色，在倒置熒光顯微鏡下發(fā)出藍色熒光，染色快(1～3 h)，標記率可達 100%[14]。

本實驗對胎鼠海馬組織來源的神經(jīng)干細胞進行了培養(yǎng)及鑒定，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細胞 Nestin 呈陽性反應，分化后細胞特異性標志物NSE、GFAP、CNP表達陽性，并且培養(yǎng)的細胞能夠分裂增殖，證明培養(yǎng)的細胞是神經(jīng)干細胞，為以后的神經(jīng)干細胞耳蝸移植試驗奠定了基礎(chǔ)。本文如果能對NSE+GFAP+CNP進行多重免疫熒光標記鑒定，則能更進一步驗證神經(jīng)干細胞的多向分化潛能，此為今后的研究方向。