浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭 州 3 10053

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)隨著人口老齡化而增加，其特征是骨量減少和骨組織的微結(jié)構(gòu)惡化，導(dǎo)致骨骼脆性和骨折[1]。當(dāng)骨形成和骨吸收之間存在不平衡時(shí)，骨代謝疾病就會(huì)發(fā)生。當(dāng)今，OP已成為全球范圍內(nèi)的嚴(yán)重問題。在中國，老年人OP的平均患病率約為15.7%，并且OP人數(shù)隨著總?cè)丝谠黾雍腿丝诶淆g化而逐漸增加[2]。正因?yàn)槿绱?，中國OP的人口將從1997年的8390萬急劇增加到2050年的2.12億[3]。因此，尋求一種有效的OP治療方式已迫在眉睫。相關(guān)研究表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在器官和組織的早期發(fā)育中起中心作用，在生理和病理?xiàng)l件下都具有骨重建的潛在作用[4]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smads信號(hào)通路在骨骼發(fā)育和修復(fù)過程中至關(guān)重要，并且BMPs的異位給藥被用于增強(qiáng)人類局部骨再生[5]。Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads可共同調(diào)節(jié)成骨，也可以在路徑激活到生物學(xué)效應(yīng)的不同階段相互調(diào)節(jié)。針對(duì)兩條信號(hào)通路的骨質(zhì)疏松藥物的研究也取得了一定進(jìn)展。本文將簡要總結(jié)Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號(hào)通路各位點(diǎn)及其相互作用對(duì)OP疾病影響的研究進(jìn)展，旨在為臨床治療OP提供新思路。

1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病

1.1Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路 在細(xì)胞水平上，Wnt激活幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括最常研究的經(jīng)典路徑，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路[6]。當(dāng)Wnt蛋白結(jié)合受體復(fù)合物時(shí)，該途徑被激活，該受體復(fù)合物包括細(xì)胞膜受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)rz）家族的7個(gè)跨膜受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[7]。該復(fù)合體將糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)和酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)動(dòng)員到膜上，在那里它們使Lrp5/6上的絲氨酸磷酸化，促進(jìn)信號(hào)體的形成，并且招募蓬亂蛋白（dishevelled，Dvl），支架蛋白（axisinhibition，Axin）和腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis Coli，APC）[8]。這將導(dǎo)致 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）釋放，增加其水平，激活的β-catenin轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，從而使胞內(nèi)的β-catenin濃度升高，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子（lymphoid enhancer，LEF）相互作用（見圖1A）。在沒有上游Wnt信號(hào)的情況下，GSK3β磷酸化β-catenin氨基末端附近的殘基，靶向β-catenin，用于泛素化途徑水解，使胞質(zhì)和胞核中的β-catenin維持在較低水平[9]（見圖1B）。Dkk1是一種特性良好的分泌型Wnt抑制劑，在許多組織中都具有活性[10]。臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Dkk1抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而抑制骨形成[11]。Dkk1一方面可競(jìng)爭性抑制Wnt配體和LRP5/6受體，另一方面Dkk1能與LRP5/6、Kremen1/2形成三聚體，通過誘導(dǎo)快速的細(xì)胞內(nèi)吞，從而減少細(xì)胞膜上的LRP5/6，以此阻斷Wnt信號(hào)向胞內(nèi)傳遞[12]（見圖1C）。

圖1 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路模型示意圖

1.2Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病的關(guān)系 Wnt信號(hào)通路因其在骨骼發(fā)育、骨量維持和再生醫(yī)學(xué)治療潛力等方面的重要性而成為骨生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究的熱點(diǎn)[11]。在骨骼發(fā)育過程中，Wnt信號(hào)參與近端-遠(yuǎn)端生長和背腹側(cè)肢體模式，隨后參與軟骨、成骨、肌肉和脂肪形成，在MSC譜系承諾和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，Wnt信號(hào)因此影響骨骼發(fā)育的各個(gè)方面，包括顱面、肢體和關(guān)節(jié)的形成[4]。例如，Lrp5和Lrp6在復(fù)合突變小鼠中的表達(dá)減少，導(dǎo)致肢體缺損[4]。成骨成熟階段開始清除Wnt蛋白分泌所需的一種伴侶蛋白wntless，可導(dǎo)致由骨形成受損和骨吸收增加引起的嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥小鼠，且這種骨質(zhì)疏松表型非常嚴(yán)重[4]。β-catenin是由細(xì)胞質(zhì)和核蛋白編碼的Ctnnb1基因，它是Wnt/β-catenin信號(hào)級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高水平的持續(xù)活躍的β-catenin抑制成熟破骨細(xì)胞和骨吸收，導(dǎo)致骨硬化病[13]。同時(shí)，阻斷Wnt/βcatenin信號(hào)途徑觸發(fā)成脂分化的啟動(dòng)[14]。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激發(fā)可以促進(jìn)成骨分化并抑制成脂分化，上述機(jī)制共同導(dǎo)致成骨的增加。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子對(duì)骨質(zhì)疏松癥有不同程度的影響。研究報(bào)告稱，LRP5基因敲除小鼠脊柱小梁骨的骨密度降低、骨質(zhì)疏松導(dǎo)致脛骨骨折[15]。然而，由β-catenin基因敲除引起的Wnt信號(hào)通路的抑制將影響骨形成，并導(dǎo)致嚴(yán)重的骨量丟失[11]。Hill等[16]研究表明，通過條件性地敲除肢體和頭部中間體中的β-catenin，顯示成骨細(xì)胞譜系分化需要β-catenin，缺乏β-catenin的成骨細(xì)胞前體在分化中被阻斷并發(fā)育成軟骨細(xì)胞。Hill等[16]通過體內(nèi)和體外損失和功能獲得分析表明，β-catenin活性是必要的，足以抑制間充質(zhì)細(xì)胞分化為Runx2和Sox9陽性骨骼前體。因此，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于骨骼譜系分化至關(guān)重要，可防止成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為軟骨細(xì)胞。

Dkk1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子特異性抑制劑，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有很強(qiáng)的治療作用。研究表明，針對(duì)性的Dkk1療法可以增加絕經(jīng)后或老年骨質(zhì)疏松癥、骨發(fā)育不良或癌癥引起的骨量流失[17]，Dkk1反義寡核苷酸可以增加去卵巢大鼠的成骨細(xì)胞數(shù)量，減少核因子RANKL的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的出現(xiàn)，股骨的骨礦物質(zhì)含量和骨密度得到提高[18]。在研究Dkk1轉(zhuǎn)基因的小鼠中，發(fā)現(xiàn)Dkk1的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的OP，并且降低成骨細(xì)胞的數(shù)量。相反，相比之下，Dkk1敲除小鼠顯示增加骨量和骨質(zhì)量[18]。這些結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控信號(hào)分子可能是治療OP的藥物靶點(diǎn)，并成為藥物治療OP的手段之一。

2 BMP-2/Smads信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病

2.1BMP-2/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路 BMPs是一種多功能生長因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中最大的一族[19-20]，是目前公認(rèn)最強(qiáng)且唯一能夠誘導(dǎo)異位成骨的細(xì)胞因子[21-22]。近年來，BMPs在胚胎發(fā)育和成年動(dòng)物細(xì)胞功能中的作用得到了廣泛的研究。BMP I型和II型受體在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中都是必不可少的。BMPs功能十分廣泛，其中BMP-2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)Smads 1、5、8是BMP受體的直接下游分子，在BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起中心作用。其具體機(jī)制為細(xì)胞外BMP-2配體可以與BMPRⅡ型受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化BMPRⅠ型受體，活化的BMPRⅠ型受體通過磷酸化BMP特異性R-Smads 1、5和8來傳遞BMP信號(hào)[23]，這些R-Smads與Smad 4復(fù)合，進(jìn)入細(xì)胞核并作為靶基因轉(zhuǎn)錄的激活因子和抑制因子起作用[24]（見圖2A）。BMPs受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，研究證實(shí)Noggin是BMPs信號(hào)的直接拮抗劑。Noggin是一種分泌的多肽，可結(jié)合BMP-2、4和7并使其失效。Noggin和BMP-7的共晶結(jié)構(gòu)表明，Noggin通過阻斷I型和II型結(jié)合表位的分子界面來抑制BMP信號(hào)[25]，并拮抗BMPs的功能[26]（見圖2B）。

圖2 BMP-2/Smads信號(hào)通路模型示意圖

2.2BMP-2/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路與骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病的關(guān)系 BMP-2/Smads信號(hào)通路在骨骼發(fā)生和骨形成過程中至關(guān)重要。BMPs是骨形成和其他細(xì)胞功能的強(qiáng)有力的刺激物，活化BMP-2信號(hào)通路能上調(diào)多種成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，缺乏BMP-2、BMP-4的小鼠不能存活。BMP-2純合子突變胚胎，胚胎平均存活時(shí)間為7.5～10.5天，并存在心臟發(fā)育缺陷，表現(xiàn)為體腔外心臟發(fā)育異常，缺乏BMP-2和BMP-4的小鼠不能存活[27]。小鼠的遺傳實(shí)驗(yàn)表明，BMP-2，BMP-4和BMP-7在肢體和顱面骨骼的圖案化和發(fā)展中發(fā)揮主要作用[28]。對(duì)缺乏BMP-2表達(dá)的小鼠的骨祖細(xì)胞檢測(cè)顯示，它們?cè)谠鲋衬芰头只删哂泄窃偕芰Φ娜δ艹晒羌?xì)胞方面存在嚴(yán)重缺陷[29]。這些結(jié)果表明，BMP-2的缺乏阻礙了骨祖細(xì)胞向骨細(xì)胞的發(fā)展。在臨床應(yīng)用中，BMP-2已被批準(zhǔn)用于由于退行性椎間盤疾病的脊柱融合和用于治療子宮內(nèi)膜異位骨折[30]。在成骨細(xì)胞中特異性刪除Smads 1基因（使用Col1-Cre小鼠）可導(dǎo)致骨量減少，說明內(nèi)源性BMPs通過Smads 1信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨量[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，在前成骨細(xì)胞分化后期，Noggin具有抑制成骨細(xì)胞分化的功能，可對(duì)已分化的成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨涎蛋白和骨鈣素形成完全抑制[32]。Noggin基因突變和缺失會(huì)導(dǎo)致多種關(guān)節(jié)異常疾病，如近端腳趾關(guān)節(jié)融合和多發(fā)骨性聯(lián)合綜合癥，所有這些都是由Noggin突變引起的常染色體顯性遺傳病[33]。所以，抑制Noggin基因的過表達(dá)不僅可增加體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的成骨作用，還能增加骨量，減少骨折的發(fā)生率。但隨著BMP-2臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，對(duì)其功效、濃度和并發(fā)癥的擔(dān)憂也隨之出現(xiàn)[34-35]，特別是脊髓手術(shù)后的各種并發(fā)癥[36]，包括椎間盤退行性骨質(zhì)溶解[37]、軟組織炎癥[38]、根性關(guān)節(jié)炎[39]、咽后間隙腫瘤[39]、異位骨化、神經(jīng)壓迫[41]和逆行性射精[42]，提示BMP-2/Smads信號(hào)通路中的分子可用于骨質(zhì)疏松靶標(biāo)的治療，但其應(yīng)用時(shí)間、濃度也應(yīng)再繼續(xù)深入研究，以期達(dá)到更好的治療骨質(zhì)疏松的效果。

3 Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads之間的調(diào)節(jié)作用

Wnt/β-catenin和BMP-2/Smads信號(hào)通路在許多生物學(xué)行為中相互重疊、互補(bǔ)或抑制。有研究顯示：BMP-2對(duì)成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)礦化的影響部分是通過誘導(dǎo)Wnt自分泌/旁分泌環(huán)介導(dǎo)的[43]，Wnt抑制劑Dkk1是成骨細(xì)胞中IA型受體（type IA receptor，BMPR1A）BMPR1A信號(hào)傳導(dǎo)的下游靶點(diǎn)，成骨細(xì)胞中BMPR1A的丟失通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)增加骨量[44]，提示兩種信號(hào)途徑之間存在著復(fù)雜的交聯(lián)關(guān)系。第一種方式是兩者共同作用于相同的靶基因，從而表現(xiàn)出疊加效應(yīng)或協(xié)同作用。在細(xì)胞內(nèi)，Smads被發(fā)現(xiàn)與Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子形成復(fù)合物，如Dvl、GSK3β、Axin和β-catenin，這些復(fù)合物調(diào)節(jié)Smads和β-catenin磷酸化和活動(dòng)[45-46]。Bain等[47]研究顯示，與用BMP-2蛋白處理相似，C3H10T1/2細(xì)胞中穩(wěn)定的β-catenin的異位表達(dá)或用LiCl激活內(nèi)源性β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)堿性磷酸酶mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而堿性磷酸酶mRNA和蛋白質(zhì)是早期成骨細(xì)胞分化的確定標(biāo)志物，與BMP2蛋白不同，穩(wěn)定的βcatenin不誘導(dǎo)骨鈣蛋白基因表達(dá)，這是晚期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物，BMP2誘導(dǎo)的分化還導(dǎo)致內(nèi)源性β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的激活，因此暗示β-catenin在BMP2介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化的早期步驟中。β-catenin和BMP2對(duì)C3H10T1/2分化的影響并不完全重疊，這意味著BMP2誘導(dǎo)的分化的某些方面可能是由βcatenin信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)，而β-catenin也可能參與非BMP2依賴的分化過程。其他研究顯示，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路增加了成骨誘導(dǎo)因子如BMP2的敏感性，并且能夠增強(qiáng)它們促進(jìn)成骨礦化和新骨形成的能力[48]。由以上研究可知，Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號(hào)通路可相互促進(jìn)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)兩者在骨質(zhì)疏松之中相互作用的研究，在單一用藥時(shí)效果不顯著或副作用較大時(shí)，可考慮聯(lián)合用藥。

第二種方式是兩者在生物體發(fā)育過程中存在負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系。Hill等[49-50]研究表明，當(dāng)干細(xì)胞發(fā)展成成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，最后一定會(huì)分化成成骨細(xì)胞。在這個(gè)階段，Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并保持其前體細(xì)胞狀態(tài)，防止進(jìn)一步分化。而BMPs信號(hào)通路可以刺激成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為成熟的成骨細(xì)胞。因此，Wnt/β-catenin和BMP-2/Smads信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞有相反的作用。最近的研究表明，BMPRIA成骨細(xì)胞靶向條件性敲除導(dǎo)致胚胎發(fā)育期間骨量增加，作為BMPRIA的下游效應(yīng)物Dkk1表達(dá)減少導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)增加[51]。高濃度的BMP-2能夠增加DKK1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)[52]。由以上研究結(jié)果可知，Wnt/β-catenin與 BMP-2/Smads信號(hào)通路存在一種負(fù)性調(diào)節(jié)作用，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)雙信號(hào)通路在臨床用藥方面的研究，在藥物機(jī)理、濃度、時(shí)間等方面進(jìn)行進(jìn)一步深入探討，以期更好的靶向用藥。

4 展望

OP的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)基因與因素。Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號(hào)通路在骨形成和破壞的調(diào)節(jié)中起著重要作用，這些通路中涉及的信號(hào)因子可以作為治療OP的藥物靶點(diǎn)，用于進(jìn)一步的深入研究。然而，隨著這些藥物的發(fā)展，還需要解決與作用模式相關(guān)的潛在問題，如骨形成過度導(dǎo)致的閉塞孔或通路減壓導(dǎo)致的假定致癌性。目前的研究表明，Wnt信號(hào)通路的非選擇性激活可能會(huì)導(dǎo)致副作用，甚至腫瘤的發(fā)生，例如大腸癌患者Dkk1表達(dá)顯著降低，這表明Wnt信號(hào)通路的激活可能與大腸癌有關(guān)，高濃度BMP2可能會(huì)增加骨膜衍生細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡并減少細(xì)胞增殖[53]，因此靶向刺激Wnt/β-catenin與BMP-2/Smads信號(hào)通路進(jìn)行定位、定量、定時(shí)的骨質(zhì)疏松靶標(biāo)治療仍需進(jìn)一步研究。繼續(xù)探索信號(hào)通路的Wnt/β-catenin和BMP-2/Smad之間的相互作用機(jī)制，并制定有效的特異性靶向激活劑或拮抗劑，這對(duì)OP藥物開發(fā)將會(huì)是一個(gè)顯著的影響，有望為OP治療開辟新的前景。