楊焰 游雪甫 李聰然

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理研究室，抗感染藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

抗生素的過度使用對細(xì)菌施加了強烈的選擇壓力，促進了抗生素耐藥菌株的進化和傳播，導(dǎo)致耐藥危機的產(chǎn)生。當(dāng)前，解決這一危機的兩個主要策略是限制抗生素的使用和開發(fā)新型抗菌藥物[3]。限制抗生素的使用被認(rèn)為不僅可以降低抗生素的使用量，也有利于消除耐藥菌，隱含其中的機制是獲得耐藥性降低了耐藥菌的適應(yīng)性[4]，即產(chǎn)生了適應(yīng)性代價(fitness cost)，使得耐藥菌在抗生素選擇壓力消失時難以與敏感菌競爭，從而很快從群體中被清除。耐藥性的適應(yīng)性代價能夠影響耐藥菌的種群動態(tài)，包括耐藥菌出現(xiàn)的速率、抗生素存在下耐藥菌的穩(wěn)定數(shù)量以及選擇壓力移除后耐藥菌的消失速率，因此適應(yīng)性代價有助于預(yù)測耐藥性的進化軌跡[5]，進而指導(dǎo)抗生素在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的合理使用；適應(yīng)性代價還有助于設(shè)計具有新型作用機制的抗菌藥物，例如開發(fā)可以與抗生素聯(lián)合使用以抑制耐藥性進化、降低細(xì)菌適應(yīng)性的輔助藥物來增加目前使用的抗生素的敏感性，從而延長當(dāng)前抗生素的使用壽命[6]。總之，從限制抗生素的使用和開發(fā)新型抗菌藥物兩個方面來講，耐藥性的適應(yīng)性代價對控制耐藥危機都具有重要的意義。

然而，耐藥菌可通過進化進一步積累其他特定突變來改善適應(yīng)性代價，這種能使其適應(yīng)性上升的突變稱為“補償性進化(compensatory evolution)”[7]，補償性進化通過各種不同的機制回復(fù)耐藥菌的適應(yīng)性代價，導(dǎo)致耐藥菌的轉(zhuǎn)移速率、毒力、生存能力的增強，這使得利用適應(yīng)性代價逆轉(zhuǎn)耐藥性的愿景變得似乎十分困難。適應(yīng)性代價和補償性突變是細(xì)菌耐藥性進化的重要環(huán)節(jié)，本文綜述了細(xì)菌病原體抗生素耐藥性的適應(yīng)性代價產(chǎn)生的原因、研究方法、研究進展及補償性進化的機制，并討論了適應(yīng)性代價研究中存在的問題及展望。

1 適應(yīng)性代價產(chǎn)生的原因

細(xì)菌耐藥的遺傳機制主要包括3種[8]：一是染色體介導(dǎo)的耐藥性，是指細(xì)菌本身固有的耐藥性或者通過染色體突變產(chǎn)生的耐藥性；二是轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥性，轉(zhuǎn)座子是基因組中可以從一個位點向另一個位點移動的一段DNA序列，轉(zhuǎn)座時可以攜帶外來的耐藥基因，從而賦予微生物對抗生素藥物的耐藥性；三是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性，質(zhì)粒是一種獨立存在的、可自身復(fù)制的染色體外的基因成分，通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在不同細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，從而賦予細(xì)菌耐藥性。細(xì)菌在面對抗生素選擇壓力時，可以通過以上變異機制獲得耐藥性，而當(dāng)抗生素壓力解除時，由于這些突變改變了其體內(nèi)在生理生化中起關(guān)鍵作用酶的結(jié)構(gòu)，某些耐藥機制會成為菌株的額外負(fù)擔(dān)，從而產(chǎn)生適應(yīng)性代價，表現(xiàn)為在沒有抗生素存在時，與野生型菌株相比，耐藥性突變株生存能力、轉(zhuǎn)移速率和毒力的降低[9]。如果某一耐藥機制的適應(yīng)性代價很大，在不存在抗生素壓力的情況下，耐藥菌株將無法與野生型菌株競爭，從而很快從群體中被清除。因此，對特定菌株的特定耐藥機制進行適應(yīng)性代價評估，有助于更加全面的理解細(xì)菌病原體抗生素耐藥性的進化軌跡。

2 適應(yīng)性代價的研究方法

細(xì)菌的適應(yīng)性代價主要通過兩種方法來衡量，一種是在流行病學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過數(shù)學(xué)模型擬合抗生素的使用量與耐藥菌株頻率變化的函數(shù)關(guān)系。Austin等[10]采用種群遺傳學(xué)方法結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)，分析了施加抗生素選擇壓力對耐藥性的影響，以及抗生素使用量與耐藥菌株頻率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類和青霉素耐藥適應(yīng)性成本很低，隨著β-內(nèi)酰胺類和青霉素使用量的增加，耐藥菌的產(chǎn)生頻率增加，但二次感染的能力降低；Whittles等[11]建立了一個數(shù)學(xué)模型，模擬了英格蘭頭孢克肟敏感菌和耐藥菌的發(fā)展史和傳播方式，并擬合了2008—2015年間Gonorrhoea感染的診斷和處方數(shù)據(jù)，認(rèn)為適應(yīng)性代價是2012年后耐藥菌檢出頻率降低的主要原因；Salvatore等[12]建立了一個以家庭為單位的病例對照研究，從流行病學(xué)的角度評價了耐藥菌的適應(yīng)性。數(shù)學(xué)模型能夠在現(xiàn)有數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上預(yù)測細(xì)菌的適應(yīng)性代價，客觀地反映抗生素與耐藥性的關(guān)系，量化維持和發(fā)展耐藥性的作用力。但是，數(shù)學(xué)模型的參數(shù)不能將所有的影響因素納入計算，應(yīng)用函數(shù)擬合只是大體上的估計，存在統(tǒng)計偏差。

適應(yīng)性代價衡量的另一種方法是實驗性方法，有部分文獻是在相同的培養(yǎng)條件下，分別測量突變型菌株和野生型菌株的生長速度，通過比較生長速度的差別來評價適應(yīng)性(圖1a)。而在大量文獻中被廣泛使用的方法是競爭性實驗，該方法被認(rèn)為是衡量適應(yīng)性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，其原理是將耐藥突變菌株與缺乏該突變的野生型菌株共培養(yǎng)時，適應(yīng)性高的菌株計數(shù)將超過適應(yīng)性較差的菌株，通過監(jiān)測野生型菌株和耐藥菌株隨時間推移相對菌計數(shù)的變化來衡量適應(yīng)性。競爭實驗包括體外實驗(圖1b)和體內(nèi)實驗(圖1c)，體外實驗通常在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中進行，體內(nèi)實驗在實驗動物中進行。為了便于區(qū)分突變型與野生型，通過用lac Z+/lac Z-或者cfp/yfp熒光蛋白基因進行菌株標(biāo)記。實驗過程中，在無抗生素的條件下將突變型和野生型菌株按照1:1的比例混合培養(yǎng)，進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，監(jiān)測一定時間內(nèi)(通常為24h)突變型和野生型菌株的數(shù)量，通過相對菌計數(shù)比例的變化來推斷突變型的適應(yīng)性，如果突變菌株具有適應(yīng)性代價，則其比例將降低，適應(yīng)性通常用選擇系數(shù)(s)來表示，選擇系數(shù)的計算主要有如下兩種方法。

Lenski等[14]提出的選擇系數(shù)計算方法如下：

sl=(突變株倍增數(shù)/野生株倍增數(shù))-1

Dykhuizen[15]估計選擇系數(shù)的公式如下：

干旱分區(qū)的指標(biāo)與分區(qū)的等級單位有密切關(guān)系。一般高等級分區(qū)如全國一級干旱分區(qū)，以反映影響干旱及其災(zāi)害的地帶性自然因素為主要依據(jù)；低等級分區(qū)主要以反映非地帶和社會因素的綜合作用為主導(dǎo)指標(biāo),較常用的是以反映水利條件和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)狀況為主的社會因素指標(biāo)來進行劃分。

圖1 適應(yīng)性代價的實驗性測量[13]Fig.1 Determining fitness of bacterial strains[13]

sd=[ln(n1f/n1i)-ln(n2f/n2i)]/No.of generations

其中，n1f和n1i是指在競爭結(jié)束時和開始時突變型菌株的數(shù)量，n2f和n2i是指在競爭結(jié)束和開始時野生型菌株的數(shù)量。

這兩種計算方式在文獻中都被廣泛采用[16-17]，但沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該選擇哪種方法。Melnyk等[18]認(rèn)為sl缺少代時這一重要的參數(shù)，他們采用了一個簡單的生長模型評價了這兩種方法的聯(lián)系，認(rèn)為sl與sd之間存在緊密的線性關(guān)系，當(dāng)競爭實驗進行了4代及更多代后，sl是sd的1.7倍。

適應(yīng)性的測量方法的不同會導(dǎo)致耐藥菌株適應(yīng)性代價的評價結(jié)果的差異，隨著分子生物學(xué)與生物信息學(xué)的發(fā)展，如今大部分的研究采用分子標(biāo)記的競爭實驗測量細(xì)菌的適應(yīng)性代價，與僅僅以生長速度表征適應(yīng)性的方法相比，競爭實驗?zāi)軌蛎枋黾?xì)菌全部生長周期的情況，包括生長速度、細(xì)菌的生理變化、毒力和轉(zhuǎn)移率等。然而，競爭性實驗并不一定能檢測到小的適應(yīng)性效應(yīng)，需要與數(shù)學(xué)模型和計算機預(yù)測相結(jié)合進行測量；競爭性實驗也不能完全的反映細(xì)菌獲得耐藥性后的生理變化，在關(guān)注相對菌計數(shù)變化的同時還應(yīng)該關(guān)注菌株全面的生理變化，綜合考量細(xì)菌的適應(yīng)性代價；另外，具體的宿主環(huán)境可以決定不同機制的抗生素耐藥適應(yīng)性成本，體外測量的結(jié)果可能無法完全反映臨床環(huán)境中的情況，還應(yīng)結(jié)合臨床研究和流行病學(xué)數(shù)據(jù)來評價細(xì)菌的適應(yīng)性代價。

3 細(xì)菌耐藥的適應(yīng)性代價

以“bacterial antibiotic resistance”和“fitness cost”為關(guān)鍵詞在PubMed數(shù)據(jù)庫進行檢索，共檢索到253篇文獻，其他文獻通過這些文獻的參考文獻進行回溯式檢索。這些研究通過體外、體內(nèi)實驗評價了不同細(xì)菌的耐藥性適應(yīng)性代價，本研究將近年來耐藥性細(xì)菌的適應(yīng)性代價研究結(jié)果進行了總結(jié)(表1)，對所統(tǒng)計的文獻進行簡要的分析發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)菌種群的復(fù)雜性，適應(yīng)性代價的測量結(jié)果也受到許多因素的影響，如細(xì)菌耐藥的遺傳機制、適應(yīng)性代價的測量環(huán)境、測量范圍等。

3.1 適應(yīng)性代價與耐藥遺傳機制

細(xì)菌耐藥性一般通過染色體突變或者攜帶耐藥基因的移動元件介導(dǎo)產(chǎn)生。Vogwill[53]采用Meta分析已發(fā)表的關(guān)于適應(yīng)性代價的文獻，發(fā)現(xiàn)相對于染色體突變介導(dǎo)的耐藥性，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性產(chǎn)生的適應(yīng)性代價更低，可能的原因是染色體突變介導(dǎo)的耐藥進化是一種從頭進化(de novo evolution)，細(xì)菌不可能從最初就具有適應(yīng)性來抵消這些基因突變產(chǎn)生的代價，而耐藥性質(zhì)粒在之前的宿主中就已經(jīng)經(jīng)歷過一次選擇，導(dǎo)致適應(yīng)性代價的相對降低，這也許可以解釋為什么由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性更加普遍。該文獻還分析發(fā)現(xiàn)相同的質(zhì)粒在不同的宿主中適應(yīng)性代價不同，說明耐藥性質(zhì)粒的適應(yīng)性代價與宿主菌的遺傳背景有關(guān)，這一觀點在染色體突變介導(dǎo)的耐藥性中也得到證明，例如在Campylobater jejuni中，其gyrA基因C257T位點發(fā)生點突變后產(chǎn)生耐藥性，Southern等[19]通過體內(nèi)競爭實驗測定不同突變菌的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)菌株遺傳背景不同的菌株適應(yīng)性代價不同。

3.2 適應(yīng)性代價隨環(huán)境的變化而不同

實驗發(fā)現(xiàn)耐藥性的適應(yīng)性代價隨著環(huán)境的變化而不同，甚至同一種突變在不同環(huán)境中，產(chǎn)生的代價也不同[54]，其內(nèi)在機制目前有幾種假說。代謝控制理論(metabolic control theory)[55]認(rèn)為在不同的環(huán)境下，細(xì)菌對突變靶酶的活性有不同水平的需求，酶活性的變化將導(dǎo)致細(xì)菌突變體的適應(yīng)性變化。Hall等[39]通過添加核糖體抑制劑間接抑制轉(zhuǎn)錄速率從而降低RNA聚合酶的需求，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對利福平的耐藥性成本降低，證明了該理論。另一種假說認(rèn)為適應(yīng)性代價在壓力條件下或營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中增加[24]，但最近有研究發(fā)現(xiàn)耐藥突變菌在營養(yǎng)受到限制的培養(yǎng)基中，相對于野生型菌株適應(yīng)性更高[25]。適應(yīng)性代價隨環(huán)境的變化而變化，體外的競爭實驗與體內(nèi)的競爭實驗往往有差異，有的體內(nèi)外結(jié)果甚至完全不同，這提示在適應(yīng)性代價研究過程中應(yīng)盡可能模擬細(xì)菌生長的真實環(huán)境，使體外測量結(jié)果與體內(nèi)測量結(jié)果相協(xié)調(diào)。

表1 耐藥細(xì)菌的適應(yīng)性代價Tab.1 The fitness cost of drug-resistant bacteria

3.3 有些耐藥性“沒有代價”

抗生素耐藥性的適應(yīng)性代價是決定耐藥菌進化成功的關(guān)鍵參數(shù)，但在細(xì)菌的適應(yīng)性代價的檢測中發(fā)現(xiàn)有些耐藥性并“沒有代價”或者表現(xiàn)出很低的代價，Baker等[22]采用改進后的經(jīng)典競爭實驗方法，檢測了傷寒沙門菌(Salmonella typhi)由于gyrA和parC基因突變導(dǎo)致對氟喹諾酮耐藥的適應(yīng)性代價，發(fā)現(xiàn)即使在抗生素不存在的情況下，11個耐藥菌株中有6個相較于敏感菌株具有顯著的適應(yīng)優(yōu)勢。對于這類沒有適應(yīng)性代價且依然保持高水平耐藥性的細(xì)菌，應(yīng)該引起更多的關(guān)注，因為這可能是臨床上治療相關(guān)耐藥菌失敗的原因[56]。某些耐藥菌的適應(yīng)性代價“沒有成本”，可能的原因是檢測手段過于單一，檢測的方法或者檢測的維度不足，這提示我們應(yīng)該進行多方面的檢測，包括體內(nèi)外的適應(yīng)性評價、細(xì)菌毒力的檢測、轉(zhuǎn)移率的評價等。另外，研究適應(yīng)性代價的實驗方法具有局限性，小的負(fù)向和正向效應(yīng)不易與中性事件區(qū)分[57]，從而導(dǎo)致某些耐藥細(xì)菌“沒有成本”。

4 補償性進化

細(xì)菌獲得耐藥性產(chǎn)生適應(yīng)性代價，使人們認(rèn)為可以通過減少抗生素的使用降低耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生頻率，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性。但適應(yīng)性代價可以通過補償進化得到改善[58]，在動物模型或培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代以后發(fā)現(xiàn)雖然有些耐藥菌的耐藥性消失，但大部分耐藥菌的耐藥性依然保持[59]。補償性進化被認(rèn)為是在沒有抗生素壓力下耐藥菌長時間持留的原因[45]。目前，補償性進化的機制主要包括以下幾種：二次突變、異位顯性(epistasis)效應(yīng)、基因重復(fù)(gene duplication)和非突變性補償。

4.1 二次突變

二次位點突變在適應(yīng)性代價的補償機制中廣泛存在[60]，是指細(xì)菌在積累某個基因的耐藥突變后，在該基因或其他功能相關(guān)基因上積累另外的突變，通過調(diào)整蛋白或蛋白復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)來回補耐藥突變導(dǎo)致的功能損傷，包括基因內(nèi)和基因外的二次補償突變。最近的研究發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，結(jié)核分枝桿菌rpoBS450L突變介導(dǎo)的利福平耐藥性的適應(yīng)性代價，可以通過rpoB基因內(nèi)的累積突變得到補償[61]。而在小鼠模型中，有研究發(fā)現(xiàn)對鏈霉素、利福平和萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門菌突變株大部分適應(yīng)性降低，但補償性進化實驗后，由于rpsL基因突變產(chǎn)生的對鏈霉素耐藥的適應(yīng)性代價通過rpsL基因內(nèi)突變以及rpsD、rpsE基因外突變得到了補償，gyrA突變產(chǎn)生的對萘啶酸耐藥的適應(yīng)性代價通過gyrA基因內(nèi)突變得到了補償，rpoB突變產(chǎn)生的對利福平耐藥的適應(yīng)性代價通過rpoB基因內(nèi)突變得到了補償[4]。大部分的二次突變研究關(guān)注于靶標(biāo)改變引起的耐藥性，Knopp等[62]研究了由外膜孔蛋白缺少而導(dǎo)致的耐藥性所賦予的適應(yīng)性是如何得到遺傳補償?shù)模麄儼l(fā)現(xiàn)適應(yīng)性代價可以通過兩種突變機制得到改善，一是phoR和pstS基因的突變導(dǎo)致PhoE孔蛋白的組成性高水平表達；二是hfq和chiX基因的突變破壞Hfq依賴性小RNA調(diào)節(jié)，導(dǎo)致ChiP孔蛋白的過表達。

4.2 異位顯性效應(yīng)

異位顯性原來的含意是指某一基因受不同位點上別的基因抑制而不能表達的現(xiàn)象[63]，而在群體遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)中指的是非等位基因的遺傳效應(yīng)的非相加性作用。異位顯性效應(yīng)對適應(yīng)性成本的影響體現(xiàn)在：正向異位顯性效應(yīng)能減少或消除適應(yīng)性代價，負(fù)向異位顯性效應(yīng)能增加適應(yīng)性代價[64]。異位顯性效應(yīng)在細(xì)菌耐藥性的進化中發(fā)揮著重要的作用[5]，在大腸埃希菌中，由拓?fù)洚悩?gòu)酶中突變引起的對氟喹諾酮類藥物的耐藥性依賴于藥物外排系統(tǒng)基因[65]；在分枝桿菌中，體外競爭實驗揭示了利福平耐藥(rpoB基因突變)和喹諾酮類耐藥(gyrA基因突變)之間的異位顯性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同的耐藥基因突變組合產(chǎn)生的適應(yīng)性代價差異顯著[66]。異位顯性效應(yīng)是一種常見的現(xiàn)象，在其他的細(xì)菌如鼠傷寒沙門菌[67]、銅綠假單胞菌[68]等也被觀察到，能夠影響細(xì)菌耐藥性的進化軌跡，對這種相互作用更深入的理解將有助于預(yù)測細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。

4.3 基因重復(fù)

基因重復(fù)是一種普遍的生物學(xué)過程，它最顯著的貢獻就是為生物的進化提供了最原始的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，通過突變和選擇的作用，重復(fù)基因可以增強生物本身的耐藥能力例如抗生素耐藥性能力，從而改變耐藥菌的適應(yīng)性[69]。Nilsson等[70]構(gòu)建了對肽去甲酰酶抑制劑具有耐藥性的Salmonella enterica突變株，在沒有抗生素的情況下，這些耐藥性突變賦予細(xì)菌適應(yīng)性代價，通過在沒有抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)fmt/folD基因的突變可以部分改善適應(yīng)性代價，在外源性補償?shù)膄mt突變體中，大約1/3攜帶相同的、重復(fù)的metZ和metW基因，這些重復(fù)基因編碼產(chǎn)生高水平的tRNAi，tRNAi水平的升高補償了甲?；D(zhuǎn)移酶活性的缺乏，并允許翻譯起始以非甲?；琢虬滨RNAi進行，因此增加了耐藥菌的適應(yīng)性。雖然基因重復(fù)在細(xì)菌耐藥性的獲得和補償性進化中十分普遍，但是重復(fù)基因尤其是小的重復(fù)片段，與突變基因相比穩(wěn)定性低，不易識別和研究[69]，基因組測序方法和生物信息學(xué)的發(fā)展將有助于基因重復(fù)的研究。

4.4 非突變性補償

以上的研究表明，抗生素耐藥機制賦予的適應(yīng)性成本可以通過基因內(nèi)或基因外第二位點的突變或者重復(fù)基因而得到改善，且通常沒有耐藥性的喪失。而研究得較少的一個潛在的補償機制是通過調(diào)控細(xì)菌生理變化來改善適應(yīng)性代價，由于生理反應(yīng)非常迅速，因此這種機制難以被確定。Olivares等[71]的研究最早提供了例證，他們發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌通過代謝重新連接(metabolic rewiring)以增加有氧呼吸，使過度表達藥物外排泵MexEF-OprN賦予的適應(yīng)性代價產(chǎn)生的有害作用降低。Freihof er等[72]也發(fā)現(xiàn)分枝桿菌通過過表達tlyArRNA甲基化酶，甲基化相鄰16S rRNA C1409位點使tlyA表達增加，導(dǎo)致16S rRNA中的點突變(特別是A1408G突變)產(chǎn)生的耐藥性所賦予的適應(yīng)性代價顯著降低。Olivares等[73]最近構(gòu)建了一組獨立過表達MexAB-OprM、MexCD-OprJ或MexXY外排泵的銅綠假單胞菌突變株，發(fā)現(xiàn)代謝補償可能是抗生素耐藥性銅綠假單胞菌突變株過量表達外排泵適應(yīng)性代價補償?shù)耐ㄓ脵C制。Zampieri等[74]結(jié)合代謝組學(xué)方法和基因組測序，建立了一種新的模型，分析了代謝作用對于細(xì)菌耐藥性進化的影響，證明了抗生素耐藥性的條件依賴性補償機制。關(guān)于非突變性補償機制的研究不斷在增加，說明這一機制正在引起人們的重視，關(guān)注細(xì)菌的生理變化不僅有助于全面認(rèn)識細(xì)菌的進化過程，而且某些可對細(xì)菌產(chǎn)生不利影響生理變化可能有助于藥物的設(shè)計、細(xì)菌感染治療方案和干預(yù)策略的制定。

5 結(jié)語與展望

適應(yīng)性代價被認(rèn)為可以限制耐藥性細(xì)菌病原體的持留和傳播，因此可能成為逆轉(zhuǎn)耐藥性的方法之一，但是在沒有抗生素的情況下，補償性進化可使細(xì)菌在保持耐藥性的情況下適應(yīng)性代價得到改善。目前，對抗生素耐藥性的適應(yīng)性代價、補償性進化的研究還存在諸多問題，例如適應(yīng)性代價和補償進化是否依賴于抗生素或物種，如果具有依賴性，其內(nèi)在機制是什么？適應(yīng)性代價的大小是否與給定突變賦予的耐藥性水平存在相關(guān)性？體外測量結(jié)果如何與體內(nèi)測量結(jié)果相協(xié)調(diào)？實驗性測量結(jié)果如何與臨床觀察結(jié)果相協(xié)調(diào)？補償性進化的機制也不足以解釋所有觀察到的現(xiàn)象，存在實驗結(jié)果與臨床研究的差異。臨床研究發(fā)現(xiàn)抗生素使用停止后，病原體的耐藥性通常會下降，這表明補償性進化可能在體內(nèi)無效[75]。隨著分子生物學(xué)與生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，相信此類問題會被逐步解答，其將有助于我們更好地預(yù)防和控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展。

抗生素耐藥性產(chǎn)生的適應(yīng)性代價以及補償性進化是細(xì)菌進化的一項重要內(nèi)容，對特定菌株的特定耐藥機制進行適應(yīng)性代價評估和補償性進化的研究，將有助于更加全面的理解細(xì)菌病原體抗生素耐藥性的發(fā)展軌跡，為解決抗生素耐藥危機提供新的思路。