孫敏 王小姣 丁宇涵 王世梅 李建杰

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 英國謝菲爾德大學(xué)，謝菲爾德S3 7HF)

放線菌類群中的鏈霉菌屬(Streptomyces)是一類重要的微生物資源，其次生代謝產(chǎn)物繁復(fù)多變，產(chǎn)生的抗生素在植病生物防治方面具有重要作用[1]。放線菌產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素因其易降解、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)已成為無公害農(nóng)藥的主體和未來農(nóng)藥的發(fā)展方向[2]。白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205是本實(shí)驗(yàn)室保存的一株拮抗放線菌，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多種植物病原真菌具有較好的抑制作用，盆栽試驗(yàn)及田間試驗(yàn)表明對(duì)黃瓜枯萎病及草莓根腐病有很好的防控效果[3-4]。其發(fā)酵上清液的乙酸乙酯萃取液對(duì)黃瓜尖孢鐮刀菌及啤酒酵母等具有較強(qiáng)的抑制作用，前期對(duì)該活性物質(zhì)的性質(zhì)亦進(jìn)行了初步研究[5]，為了明確該活性物質(zhì)的成分，通過硅膠制備薄層板對(duì)其進(jìn)行分離純化，并通過1H NMR，13C NMR圖譜、紅外光譜和HPLC-Tof -HRMS鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，本文報(bào)道其分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205及啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)實(shí)驗(yàn)室分離保存[4]。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：黃豆粉30.0g，葡萄糖 5.0g，酵母膏5.0g，碳酸鈣5.0g，去離子水1000mL，pH7.5。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20.0g，可溶性淀粉30.0g，蛋白胨2.0g，黃豆粉8.0g，NaCl 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO33.0g，K2HPO4·7H2O 0.5g，去離子水1000mL，pH8.0。

1.3 S.albospinus CT205液體發(fā)酵

將S.albospinusCT205在PDA斜面上活化，用接種環(huán)取新鮮的CT205斜面孢子2～3環(huán)接種于滅菌的種子搖瓶培養(yǎng)基中(250mL三角瓶中裝液量50mL)，于28℃搖床，170r/min培養(yǎng)48h，鏡檢菌絲生長旺盛，確認(rèn)無污染后，以10%接種量接種到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中(1000mL三角瓶中裝液量300mL)，28℃搖床發(fā)酵96h，得S.albospinusCT205的發(fā)酵液。發(fā)酵過程中定時(shí)取樣，觀察菌絲體形態(tài)，測定發(fā)酵液pH值變化，并用牛津杯法測定發(fā)酵液粗提物拮抗圈的大小，用以表征活性成分相對(duì)含量的變化。拮抗圈大小的測定方法：取發(fā)酵液，6000r/min，4℃，離心15min，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，按50:1的比例獲得濃縮液，取200μL加入牛津杯中，以啤酒酵母為指示菌(每皿涂布100μL 108/mL啤酒酵母細(xì)胞)，測定拮抗圈的大小。

1.4 S.albospinus CT205代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)的提取及純化

活性物質(zhì)的提取及檢測參照文獻(xiàn)[5]上的方法進(jìn)行。即將發(fā)酵液離心，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取，收集酯相，減壓濃縮，獲得粗提物，用甲醇溶解，用毛細(xì)管取少量點(diǎn)樣在GF254硅膠板，進(jìn)行薄板層析，層析系統(tǒng)為氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(16:1:2:0.04)，展層結(jié)束，在紫外光下觀察各斑點(diǎn)位置，計(jì)算其Rf值，并佐以生物自顯影法[6]，確認(rèn)活性成分的位置。

根據(jù)上述結(jié)果通過制備型硅膠板(10cm×20cm)進(jìn)行層析分離，割取活性物質(zhì)對(duì)應(yīng)條帶，用甲醇浸泡24h，6000r/min，4℃，離心5min，取上清液，減壓濃縮后獲得活性成分，再用GF254薄板檢測斑點(diǎn)是否單一，如斑點(diǎn)不單一，再重復(fù)進(jìn)行制備型硅膠板層析分離，獲得單體化合物。取少量用甲醇稀釋，以啤酒酵母為指示菌用牛津杯法檢測其抗菌活性。

1.5 活性物質(zhì)紫外(UV)吸收光譜檢測

紫外可見分光光度計(jì)(美國Perkin Elmer，Lambda 25)對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行全波長(190～400nm)紫外掃描，以分析純甲醇溶液做參比。

1.6 活性物質(zhì)HPLC-Tof -HR-MS檢測

將割板制備的活性物質(zhì)，先用少量甲醇溶解，然后用甲醇溶液高倍稀釋(×1000)，紙片法檢測抗菌活性仍有較大抑菌圈。將樣品稀釋液過0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行預(yù)處理，再送樣到分析型HPLC(Waters公司)檢測，泵型號(hào)1525，紫外檢測器型號(hào)2487，色譜柱型號(hào)Waters 4.6mm×150mm C18反向柱，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相：甲醇:水=60:40，并根據(jù)樣品極性進(jìn)行調(diào)整。在此基礎(chǔ)上采用相同流動(dòng)相，利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜TripleTof?5600+MS系統(tǒng)(AB SCIEX公司，TripleTof?00的升級(jí)產(chǎn)品)檢測。HPLC-Tof -HR-MS檢測在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.7 活性物質(zhì)核磁共振(NMR)波譜檢測

1H NMR檢測，稱取樣品及放線酮標(biāo)準(zhǔn)品3～5mg分別溶于0.5mL CD3OD中。13C NMR檢測，稱取樣品及其標(biāo)準(zhǔn)品各30～35mg溶于0.5mL CD3OD中，檢測。采用德國Bruker UltraShiedTM400 Plus核磁共振波譜儀檢測(TMS為內(nèi)標(biāo))。

1.8 活性物質(zhì)紅外光譜(FTIR)檢測

采用傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行紅外光譜(FTIR)分析。將甲醇溶解的樣品在紅外光譜儀上進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 S.albospinus CT205液體發(fā)酵

S.albospinusCT205在種子搖瓶培養(yǎng)48h后，接種發(fā)酵搖瓶，定期取樣觀察菌絲生長情況，結(jié)果見圖1。在油鏡(10×100)下觀察菌絲形態(tài)變化，CT205在培養(yǎng)24h后菌絲快速生長，48～72h菌絲生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，呈網(wǎng)狀分布，72～96h菌絲生長進(jìn)入穩(wěn)定期。

發(fā)酵過程中取樣測定發(fā)酵液pH值的變化及發(fā)酵液中活性物質(zhì)抑菌圈的大小，結(jié)果如圖2所示。接種后發(fā)酵起始pH=6.89，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，pH值呈下降趨勢，24h時(shí)pH=6.56，較起始階段下降0.33個(gè)單位，72h時(shí)pH降至6.41，96h后的pH=6.12，較起始降低0.88個(gè)單位。發(fā)酵液中活性物質(zhì)的含量，則隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增加，發(fā)酵48h抑菌圈直徑58.5mm，72h時(shí)抑菌圈68.2mm，96h時(shí)抑菌圈達(dá)到72.7mm。

2.2 活性物質(zhì)的提取及純化

S.albospinusCT205搖瓶發(fā)酵96h后，離心取上清，用乙酸乙酯萃取，離心取酯相，減壓濃縮得濃縮液，用甲醇溶解。選用GF254硅膠板展層，經(jīng)紫外觀察及生物檢測Rf=0.68的組分具有抗菌活性。在制備型硅膠板上多次層析分離，割取有活性的條帶，用甲醇浸泡24h，濃縮回收樣品，TLC純度驗(yàn)證，最終獲得純化的化合物。

2.3 活性物質(zhì)的紫外吸收光譜

圖1 S.albospinusCT205發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)變化(10×100)Fig.1 Change of mycelia morphology during the fermentation of S.albospinus CT205(10×100)

圖2 S.albospinus CT205發(fā)酵液pH及活性物質(zhì)相對(duì)含量變化Fig.2 Changes of pH and relative content of active substance in S.albospinus CT205 fermentation broth

前期研究發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)對(duì)熱和紫外線均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性[5]，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，耐熱、耐紫外輻射且抗真菌的抗生素種類并不多，放線酮(actidione)具有與此相似的特性[7]。將待測活性物質(zhì)與放線酮標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖3所示，兩者的紫外吸收光譜相似，最大吸收峰均在λ=215nm處。

圖3 活性物質(zhì)和放線酮的紫外吸光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of active substance and actidione

2.4 活性物質(zhì)的HPLC-Tof -HR-MS檢測

對(duì)活性成分進(jìn)行HPLC-Tof -HR-MS檢測，其一級(jí)質(zhì)譜圖(圖4)的質(zhì)荷比(m/z)為282.1701，二級(jí)質(zhì)譜圖(圖5)的分子離子峰的m/z為282.1692，離子提取流圖(XIC)(圖6)分析發(fā)現(xiàn)該活性成分在正離子峰模式下的分子離子峰為[M+H]+=282.2，可以確定其分子量為282.2，其與放線酮標(biāo)準(zhǔn)品的分子量(282.2)及一級(jí)質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖一致(限于篇幅放線菌酮標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜圖未列出)。

圖4 活性物質(zhì)及放線酮一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Primary mass spectrograms of active substance and actidione

圖5 活性物質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrogram of active substance

圖6 離子提取流圖Fig.6 Extracted ion chromatogram

圖7 放線酮結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structure of actidione

根據(jù)活性成分二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)合放線酮的結(jié)構(gòu)式(圖7)及其斷鍵的位置可以看出當(dāng)A、B兩處的化學(xué)鍵同時(shí)斷裂時(shí)，可以得到鏈狀結(jié)構(gòu)-C(OH)-CH2-C(O)-CH2(CH2)-CH2-CH(CH3)-CH2-和六元環(huán)結(jié)構(gòu)NH(CO)2(CH2)2C-CH2-，并且該斷裂結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的m/z分別為157和119。由此可以得到部分的質(zhì)譜裂解圖：從m/z=282到m/z=265，失去m/z=17的碎片，此碎片為叔碳所連接的羥基結(jié)構(gòu)的分子量，從m/z=282到m/z=157，失去m/z=124的碎片，此碎片為叔碳所連接的羥基及其仲碳連接的羰基的六元環(huán)同時(shí)被打碎，所剩下的肽鍵所連接的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子量。根據(jù)分子離子峰(m/z=282.2)：質(zhì)譜圖的主要裂解碎片解釋如圖8所示。從XIC中(圖6)可以看出該活性成分的保留時(shí)間(tR=4.953min)與放線酮的保留時(shí)間(tR=4.951min)一致，經(jīng)圖譜比對(duì)可以確定在tR=4.953min處的化合物成分即是放線酮，又稱環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)其分子式為C15H23NO4。

2.5 活性物質(zhì)的核磁共振波譜

根據(jù)HPLC-Tof -HR-MS的檢測結(jié)果得出該活性物質(zhì)為放線酮，分子式C15H23NO4。根據(jù)已知分子式對(duì)該活性物質(zhì)及其放線酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行NMR波譜檢測。對(duì)樣品的1H NMR譜、13C NMR譜結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δH:4.02(q,J=5.9Hz,1H),3.31(p,J=1.7Hz,1H),2.79～2.51(m,4H),2.42～2.30(m,3H),2.22～2.13(m,1H),2.12～2.01(m,1H),1.98～1.86(m,1H),1.75(td,J=13.2,4.8Hz,1H),1.59(td,J=13.0Hz,4.7Hz,1H),1.50～1.41(m,2H),1.27(d,J=7.1Hz,3H),0.95(d,J=6.4Hz,3H)；13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δC:214.8,174.3,174.2,66.2,50.8,42.7,40.3,39.8,38.0,36.5,35.2,27.6,27.0,17.2,13.4。同時(shí)將活性物質(zhì)的1H NMR譜、13C NMR譜檢測結(jié)果與放線酮的1H NMR譜、13C NMR譜檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，譜圖數(shù)據(jù)相一致，故確認(rèn)該活性物質(zhì)為放線酮。

2.6 活性物質(zhì)的紅外光譜

圖8 活性物質(zhì)質(zhì)譜離子碎片裂解圖Fig.8 Ion fragmentation diagram of active substance by mass spectrometry

活性物質(zhì)含有不同的結(jié)構(gòu)和原子組成的功能基團(tuán)，從紅外光譜可以獲得該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，活性物質(zhì)在3000～3600cm-1處具有吸收峰，可以判定該物質(zhì)為有機(jī)物，根據(jù)(表1，圖9)物質(zhì)的FTIR特征吸收峰及歸屬，可以看出，該活性物質(zhì)在3297cm-1處有一個(gè)-N-H伸縮振動(dòng)峰，放線酮在3300處有一個(gè)同樣的-N-H伸縮振動(dòng)峰，判定該活性物質(zhì)為存在-NH酰胺類有機(jī)化合物。2943cm-1是-N-H的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，2833cm-1是-C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1451cm-1是-C-H彎曲振動(dòng)吸收峰，1411cm-1是-C-N伸縮振動(dòng)吸收峰，1111和1022cm-1是碳水化合物的-C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，598cm-1是-OH面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰[8-9]。綜上所述，該活性物質(zhì)為含有-NH2、-OH等多種官能團(tuán)的胺類化合物。同時(shí)與放線酮標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜比對(duì)分析得出該活性物質(zhì)與放線酮的紅外光譜在不同頻率下產(chǎn)生的官能團(tuán)伸縮振動(dòng)吸收峰的響應(yīng)值的位置范圍(表1)相一致。進(jìn)而判斷該活性物質(zhì)與放線酮為同一物質(zhì)，即該活性物質(zhì)為環(huán)己酰亞胺，詳情如表1。

表1 活性物質(zhì)FTIR特征吸收峰及歸屬Tab.1 The characteristic absorption peaks and attribution of active substance FTIR

圖9 活性物質(zhì)與放線酮紅外光譜比對(duì)Fig.9 Infrared spectra of active substance and actidione

3 討論

S.albospinusCT205代謝所產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，薄板層析、生物檢測及生物顯影檢測，確定了其Rf值，并用制備型硅膠板分離獲得小批量物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)該活性成分對(duì)熱和紫外線均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，查閱《抗菌素生物理化特征》[7]，發(fā)現(xiàn)放線酮具有類似特性。將活性成分進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其在215nm處具有最大吸收峰，吸收光譜圖與放線酮相似。對(duì)該活性成分進(jìn)行了HPLCTof -HR-MS檢測，從一級(jí)質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖檢測的結(jié)果確定該物質(zhì)的分子量為282.2，XIC圖顯示在tR=4.953min處有最大吸收峰值。與HPLC-Tof -HRMS檢測的放線酮標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)待測物質(zhì)與放線酮的一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜及XIC圖譜的結(jié)果一致，確定其分子量和放線酮標(biāo)準(zhǔn)品相同。經(jīng)紅外光譜檢測，碳譜氫譜數(shù)據(jù)分析，得到該物質(zhì)的分子式，功能基團(tuán)和基本骨架結(jié)構(gòu)，并且通過與放線酮標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜，1H NMR譜，13C NMR譜圖進(jìn)行比對(duì)分析，佐證了該活性物質(zhì)就是放線酮，其分子式為C15H23NO4，又稱環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)。

早在1948年德國化學(xué)家Ford和Leach從灰色鏈霉菌(S.griseus)中分離鑒定出放線酮，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酵母菌拮抗作用強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌無作用或拮抗作用較小[10]。蔡潤生等[11]研究報(bào)道金色鏈霉菌(S.saureus)除代謝產(chǎn)生制霉菌素外，還產(chǎn)生另外一種抗生素—放線酮，具有較強(qiáng)的抗病原真菌能力。放線酮是廣譜抗生素，在防治農(nóng)作物真菌病害上應(yīng)用廣泛，如用于防治煙草黑脛病、煙草赤星病、小麥銹病、茶葉立枯病和玫瑰霉病等[12]。閆貴龍等[13]曾研究用放線酮防控青貯玉米霉變，效果良好，同時(shí)放線酮也是鼠類的忌避劑[14]。

放線酮能夠特異性地抑制新蛋白質(zhì)的合成，因此常作為蛋白質(zhì)合成過程的有效抑制劑，應(yīng)用于蛋白的表達(dá)、細(xì)胞凋亡機(jī)制等代謝調(diào)控方面的研究，在醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)上有廣泛的用途[15-18]，如譚曉華等[15]的試驗(yàn)結(jié)果表明1.0～2.0μg/mL的放線酮能拮抗兒茶素誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞株的凋亡；王小輝[19]報(bào)道放線酮可以有選擇性的誘導(dǎo)人原單核白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞凋亡。放線酮雖然是一個(gè)古老的抗生素，但仍然有許多新功能有待挖掘。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心徐江艷老師在HPLC-Tof -HR-MS檢測上給予的幫助。