邢 進(jìn)，胡水清

作者單位:(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科

0 引言

近年來隨著生活水平的提高，人們越來越多的不良飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣和社會(huì)人口的老齡化致使糖尿病的發(fā)病率逐年升高，糖尿病最常見的并發(fā)癥之一就是白內(nèi)障［1］。糖尿病白內(nèi)障是我國排名第2位的致盲眼病，僅次于視網(wǎng)膜病變，每年白內(nèi)障患者都在以幾十萬的數(shù)目累積增加，大部分白內(nèi)障都是由于糖尿病而引起的，發(fā)病原因復(fù)雜，氧化性損傷和晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡在其中發(fā)揮了重要作用［2］。芪三酚又被稱為白藜蘆醇，是一種非黃酮類的多酚化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎功能和清除自由基的功能［3］。體質(zhì)量和血糖水平是檢測糖尿病的重要指標(biāo)，糖尿病患者在患病后體質(zhì)量會(huì)下降，血糖升高［4］。本研究通過使用芪三酚對糖尿病白內(nèi)障模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，對大鼠體質(zhì)量、血糖指標(biāo)和肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇進(jìn)行觀察，探究芪三酚對糖尿病白內(nèi)障進(jìn)展的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料 選取SD健康大鼠30只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中雌性大鼠16只，雄性大鼠14只，年齡 7～10(平均 8.4±0.3)周齡，體質(zhì)量為210～240(230.6±23.4)g，飼養(yǎng)溫度為22℃～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時(shí)進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許自由活動(dòng)，飼養(yǎng)時(shí)間為1wk，符合動(dòng)物保護(hù)條例。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 建模處理 將大鼠隨機(jī)分成三組，每組各10只，分別為空白組、模型組和治療組?？瞻捉M大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，模型組和治療組大鼠進(jìn)行建模處理(糖尿病白內(nèi)障模型)，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量按照50mg/kg腹腔內(nèi)注射經(jīng)0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液稀釋后的鏈脲霉素溶液，在對大鼠注射3d后取大鼠尾部靜脈血檢查大鼠的空腹血糖值，當(dāng)大鼠的空腹血糖值＞14mmol/L時(shí)則表示建模成功，空白組大鼠建模期間注射等體積生理鹽水。從建模成功第1d開始，對治療組大鼠按照100mg/kg給予芪三酚灌胃處理，每天1次［5］，空白組和模型組大鼠不做干預(yù)，5wk后觀察三組大鼠具體情況。

1.2.2 晶狀體檢查 在注射干預(yù)5wk后，分別將三組大鼠使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液進(jìn)行散瞳，10min后手持裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠左眼晶狀體混濁情況。晶狀體透明沒有混濁的為0級，記為0分;晶狀體輕度混濁，周邊有空泡，核分界明顯的為Ⅰ級，記為1分;晶狀體呈現(xiàn)中度混濁，且周圍的空泡向中間聚集的為Ⅱ級，記為2分;晶狀體高度混濁并且周圍的空泡已經(jīng)聚集到核區(qū)使核區(qū)呈現(xiàn)霧狀混濁的為Ⅲ級，記為3分;晶狀體中核完全混濁沒有界限的為Ⅳ級，記為4分，是成熟的白內(nèi)障。根據(jù)各組大鼠白內(nèi)障的評分情況乘以相應(yīng)個(gè)數(shù)，得出各組白內(nèi)障大鼠整體評分后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.2.3 體質(zhì)量稱重 分別于第3、5wk將三組大鼠注射麻醉藥進(jìn)行麻醉后，放置于電子秤上對大鼠進(jìn)行稱重，取平均值，單位為克(g)。將大鼠放置于桌面，使其身體呈伸直狀態(tài)并背面朝上，使用尺子從大鼠頭部量至尾部根部，其長度為大鼠身長，單位為厘米(cm)。

1.2.4 血糖水平檢測 分別于建模后第3、5wk，在三組大鼠餐前空腹時(shí)和餐后2h在尾端用75%酒精消毒后針刺取血，將待測血樣加入肝素抗凝試管中，使用葡萄糖氧化酶法對三組大鼠空腹血糖(FPG)和餐后2h血糖(2hPG)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照自動(dòng)分析儀操作說明書進(jìn)行。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定肌酐、尿素氮 取三組大鼠第5wk采集的血樣，采用50mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20μg/mL，在96孔酶標(biāo)板中加入100μL/孔，4℃過夜保存。第2d舍棄包被液，采用 PBST洗滌3次，每孔中加入150μL 1%BSA，在37℃環(huán)境中封閉1h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100μL不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2h。采用PBST洗滌5次，加入100μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h。PBST洗滌5次后，使用顯色劑顯色20min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值，從而測定肌酐、尿素氮的表達(dá)水平。

1.2.6 化學(xué)發(fā)光分析法檢測甘油三酯和總膽固醇表達(dá)水平 取三組大鼠第5wk采集的血樣，待測標(biāo)本加入化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，與催化劑發(fā)生催化反應(yīng)，與氧化劑發(fā)生氧化反應(yīng)，形成處于激發(fā)狀態(tài)的中間體，當(dāng)中間體達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，會(huì)發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照化學(xué)發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號(hào)測量儀測量光子數(shù)值，對比分析甘油三酯、總膽固醇表達(dá)水平。

1.2.7 切片處理 三組大鼠在干預(yù)5wk后采用斷頭法處死，摘除右眼眼球，在平衡液下沖吸，取出完整晶狀體，并盡量將周圍虹膜、玻璃體和懸韌帶等組織去除，制作石蠟切片。先置于4%多聚甲醛中固定，然后取出用PBS緩沖液沖洗，放入緩沖液中浸泡洗滌，10h后吸干周圍水分，使用梯度酒精脫水處理后再用二甲苯透明處理30min，最后浸蠟和常規(guī)石蠟包埋。

1.2.8 HE染色處理 對三組大鼠切片樣本進(jìn)行染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5min，然后在梯度酒精下水化處理3min，自來水沖洗1次;使用蘇木素染色5min，自來水沖洗1次;使用1%鹽酸酒精分化處理30s，在0.2%氨水中返藍(lán)處理2min，自來水沖洗1次;0.5%伊紅染色10min，自來水沖洗1次;使用乙醇進(jìn)行梯度脫水處理，最后用中性樹膠進(jìn)行封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)描述，三組間比較采用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用配對樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比進(jìn)行描述。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠晶狀體情況 空白組大鼠晶狀體透明，未見混濁;模型組大鼠在散瞳后晶狀體呈現(xiàn)白色混濁，皮質(zhì)與核融為一體無界限;治療組大鼠有部分晶狀體的皮質(zhì)呈現(xiàn)不規(guī)則乳白色的絮狀混濁，晶狀體核尚呈透明狀(圖1)。

2.2 三組大鼠晶狀體病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞分布均勻、形態(tài)規(guī)則，晶狀體囊膜和相鄰細(xì)胞結(jié)合緊密，晶狀體纖維細(xì)胞沒有異常表現(xiàn);模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、分布不均勻，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核縮小，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、不均勻;治療組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞相比模型組大鼠上皮細(xì)胞排列較為緊密，胞質(zhì)中空泡個(gè)數(shù)少于模型組大鼠(圖2)。

2.3 三組大鼠晶狀體混濁程度比較 空白組大鼠晶狀體透明，無混濁現(xiàn)象;治療組大鼠晶狀體混濁程度和白內(nèi)障整體評分均顯著優(yōu)于模型組大鼠(表1)。

2.4 三組大鼠體質(zhì)量和身長的比較 空白組、治療組大鼠第5wk的體質(zhì)量顯著高于第3wk，模型組大鼠第5wk的體質(zhì)量顯著低于第3wk，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.71、17.28、17.01，均P＜0.001);三組大鼠第5wk的身長明顯長于第3wk的身長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.79、2.94、5.67，均P＜0.05);治療組大鼠治療第3、5wk時(shí)的體質(zhì)量與身長明顯高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表 2)。

2.5 三組大鼠血糖水平的變化 模型組大鼠第5wk的FPG、2hPG水平顯著高于第3wk，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.85、4.35，均 P＜0.001);治療組大鼠第 5wk 的 FPG、2hPG水平顯著低于第3wk，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.26、7.30，均P＜0.001);治療組大鼠第3、5wk時(shí)的FPG、2hPG水平明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

圖1 三組大鼠晶狀體情況 A:空白組;B:模型組;C:治療組。

圖2 三組大鼠晶狀體病理組織學(xué)觀察(HE×100) A:空白組;B:模型組;C:治療組。

表1 三組大鼠處理5wk 后晶狀體混濁程度和整體評分比較

表2 三組大鼠體質(zhì)量和身長的變化x珋±s

表3 三組大鼠血糖水平的變化(，mmol/L)

表3 三組大鼠血糖水平的變化(，mmol/L)

注:空白組:不做處理;模型組:進(jìn)行糖尿病白內(nèi)障模型處理;治療組:糖尿病白內(nèi)障模型+芪三酚處理。aP＜0.05 vs空白組;cP＜0.05 vs模型組。

組別 只數(shù) FPG 2hPG第3wk 第5wk 第3wk 第5wk空白組 10 3.72±0.48 3.43±0.76 7.17±1.26 7.24±1.27模型組 10 15.46±1.12a 20.27±3.79a 24.37±2.14a 29.58±3.12a治療組 10 10.47±0.65a，c 5.61±0.86a，c 15.24±1.89a，c 10.25±1.05a，c F 12.19 11.93 10.11 18.57 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化 第5wk時(shí)，模型組和治療組的尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平相比空白組都有明顯上升，肌酐表達(dá)水平相比空白組有明顯下降，其中治療組的尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平相比模型組有明顯下降，肌酐水平相比模型組有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表4)。

表4 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化

表4 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化

注:空白組:不做處理;模型組:進(jìn)行糖尿病白內(nèi)障模型處理;治療組:糖尿病白內(nèi)障模型+芪三酚處理。aP＜0.05 vs空白組;cP＜0.05 vs模型組。

組別 只數(shù) 肌酐(c/μmol·L－1) 尿素氮(c/mmol·L－1) 甘油三酯(c/mmol·L－1) 總膽固醇(c/mmol·L－1)空白組 10 39.42±4.34 6.69±1.10 0.97±0.65 2.15±0.20模型組 10 22.63±2.20a 19.92±3.03a 1.78±1.22a 2.76±0.25a治療組 10 30.79±3.75a，c 17.39±1.18a，c 1.02±1.09a，c 2.34±0.20a，c F 5.94 2.48 1.47 4.15 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

白內(nèi)障是一種常見眼部并發(fā)癥，主要由糖尿病引起，以老年患者為主［6］。有研究表明，糖尿病白內(nèi)障多是受醛糖還原酶影響，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)山梨醇堆積后，就會(huì)引起滲透壓的變化，眼內(nèi)部的房水滲透壓增高，從而使得晶狀體內(nèi)部的纖維水腫，進(jìn)而產(chǎn)生斷裂或崩裂現(xiàn)象，晶狀體逐漸退化，最終晶狀體混濁，從而形成糖尿病白內(nèi)障［7－8］。本研究選取健康SD大鼠進(jìn)行糖尿病白內(nèi)障模型的建造，然后對糖尿病白內(nèi)障大鼠使用芪三酚進(jìn)行干預(yù)，通過檢測大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)，判斷芪三酚用于糖尿病白內(nèi)障治療的效果。

芪三酚也稱白藜蘆醇，是一種能夠產(chǎn)生自身抗逆性的非黃酮類多酚化合物，同時(shí)也是一種重要抗毒素，存在于多種植物中，具有調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗低密度脂蛋白氧化、抗病毒等多種作用［9－10］。同時(shí)芪三酚還具有強(qiáng)大的抗炎與清除活性氧自由基的能力，能夠維持晶狀體的氧化還原程度［11］。糖尿病引起的白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞密度會(huì)明顯低于正常的白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞密度，并且前后囊膜混濁的程度也明顯高于正常的白內(nèi)障前后囊膜混濁程度［12－13］。本研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障大鼠晶狀體給藥治療后有部分晶狀體的皮質(zhì)呈現(xiàn)不規(guī)則乳白色的絮狀混濁，晶狀體核尚呈透明狀，并且發(fā)現(xiàn)其晶狀體混濁程度多數(shù)在Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級，說明芪三酚對晶狀體的混濁程度有著明顯的改善作用，能夠有效緩解白內(nèi)障。與李青春等［10］研究保持一致。芪三酚在降低血糖的同時(shí)促進(jìn)機(jī)體營養(yǎng)素的吸收［14］，本研究結(jié)果顯示，芪三酚灌注的大鼠體質(zhì)量和身長增加，說明芪三酚能夠改善大鼠體質(zhì)量，促進(jìn)其恢復(fù)。

糖尿病白內(nèi)障不僅會(huì)使機(jī)體內(nèi)的血糖水平產(chǎn)生異常，還可能會(huì)出現(xiàn)肝腎功能的損壞［15］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病白內(nèi)障大鼠FPG與2hPG檢測水平明顯上升，芪三酚干預(yù)后，F(xiàn)PG與2hPG水平顯著降低，且隨著時(shí)間的推移，下降趨勢更加明顯，說明芪三酚對于糖尿病性白內(nèi)障確有降低血糖的作用。張劍等［16］研究也指出，芪三酚能夠改善大鼠血糖水平，本研究結(jié)果與其保持一致，說明芪三酚能夠達(dá)到與其相同的治療效果。肌酐和尿素氮是檢測腎功能的重要指標(biāo)，血清肌酐一般認(rèn)為是人體肌肉代謝的產(chǎn)物［17］。維持人體內(nèi)基礎(chǔ)物質(zhì)的蛋白質(zhì)會(huì)被葡萄糖燃燒掉，其他營養(yǎng)素被轉(zhuǎn)化成為蛋白質(zhì)之后又會(huì)被葡萄糖燃燒后排出體外，尿素氮是血漿中除了蛋白質(zhì)之外的另一種含氮化合物，是人體蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物［11］。甘油三酯和總膽固醇的升高說明血脂升高，甘油三酯可以促進(jìn)肝臟糖原的合成，加重糖尿?。?8］。根據(jù)本研究，對大鼠進(jìn)行芪三酚灌注治療后，血清肌酐水平有所上升，尿素氮、甘油三酯和總膽固醇的表達(dá)水平有所下降，說明芪三酚可以使機(jī)體內(nèi)有關(guān)血糖和腎功能的指標(biāo)恢復(fù)。

綜上所述，芪三酚能夠改善糖尿病白內(nèi)障大鼠晶狀體的混濁程度，減輕疾病對大鼠體質(zhì)量的影響，控制大鼠血糖水平以及肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇等生化指標(biāo)水平，從而緩解白內(nèi)障的進(jìn)展程度，為臨床中糖尿病白內(nèi)障的治療提供了重要的理論依據(jù)。