儲(chǔ)昭節(jié)，王 彤，馬 強(qiáng)，范晶晶，蔡 敏

作者單位:(710002)中國(guó)陜西省西安市第一醫(yī)院眼科西安市眼科醫(yī)院陜西省眼科研究所

0 引言

Vogt－小柳原田(Vogt－Koyanagi－Harada syndrome，VKH)綜合征是一種由自身免疫反應(yīng)引發(fā)的攻擊黑色素細(xì)胞抗原導(dǎo)致的致盲性眼病，以雙側(cè)肉芽腫性全葡萄膜炎為主要特征，還可侵襲耳、腦脊髓膜、毛發(fā)、皮膚等器官［1］。VKH綜合征的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，病毒感染、自身免疫等因素均參與了VKH的發(fā)病。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)－22屬于 IL－10細(xì)胞因子家族成員，主要由CD4+T細(xì)胞分泌，IL－22的受體僅表達(dá)在組織器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，因此IL－22介導(dǎo)的信號(hào)通路主要參與組織器官炎癥應(yīng)答的調(diào)控，在腫瘤、感染和自身免疫性疾病中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用［2－3］。IL－22的表達(dá)受多種因素的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)表達(dá)調(diào)控CD4+T細(xì)胞分泌 IL－22，誘導(dǎo)肝臟炎癥應(yīng)答［4－6］。但有關(guān) IL－22 在VKH綜合征患者中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究觀察了Notch受體和IL－22在VKH綜合征患者中的表達(dá)，并評(píng)估VKH患者中Notch信號(hào)通路對(duì)CD4+T細(xì)胞分泌IL－22的調(diào)控作用，以期初步闡釋VKH綜合征的免疫發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016－09/2018－06本院就診的VKH綜合征患者35例，其中活動(dòng)期15例，男8例，女7例，年齡29～55(平均39.0±11.9)歲，活動(dòng)期患者采集標(biāo)本時(shí)未接受任何藥物治療;靜止期20例，男10例，女10例，年齡31～54(平均39.2±12.1)歲，靜止期患者使用免疫抑制劑治療1a以上，炎癥靜止3mo以上。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18～65歲;(2)符合國(guó)際命名委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)以及楊培增教授提出的參考標(biāo)準(zhǔn)［1，7］;(3)獲得知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并慢性病毒感染;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)合并惡性腫瘤;(4)合并心、腦、肺、肝臟等重要臟器功能障礙;(5)妊娠期或哺乳期婦女。選取同時(shí)期在我院進(jìn)行體檢的12例志愿者作為健康對(duì)照者，男7例，女5例，年齡28～55(平均37.1±10.8)歲，健康對(duì)照的年齡和性別比例與VKH綜合征患者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究方案已經(jīng)在本院倫理委員會(huì)備案并獲得批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究了解并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 血漿和CD4+T細(xì)胞的分選 清晨、空腹采集研究對(duì)象EDTA抗凝外周血10mL，3 000g/min離心10min，收集上層血漿，凍存于－80℃?zhèn)溆谩Ｏ聦友?xì)胞使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司)、采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用CD4+細(xì)胞分選試劑盒(德國(guó)美天旎公司)按說(shuō)明書(shū)要求分選外周血單個(gè)核細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞。

1.2.2 CD4+T細(xì)胞的刺激 培養(yǎng)取106個(gè)分選的CD4+T細(xì)胞，加入抗CD3/CD28抗體(終濃度1μg/mL)，同時(shí)加入Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT(美國(guó)Selleck公司，終濃度75μmol/L)刺激培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)細(xì)胞和上清。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) 使用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，取1μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞士羅氏公司)將總 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，使用FastStart DNA Master SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(瑞士羅氏公司)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列根據(jù)既往文獻(xiàn)［5，8］合成。采用50μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:預(yù)變性:94℃ 5min;PCR 反應(yīng) 94℃ 10s，50℃ 20s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2－ΔΔCt法對(duì)目的片段的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot 取 5×105個(gè) CD4+T細(xì)胞，加入250μL 2×SDS 緩沖液+5μL β－巰基乙醇裂解細(xì)胞，孵育5min后于95℃靜置10min，離心后將待測(cè)樣本加入SDSPAGE電泳濃縮膠孔中，100V將蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBS－T封閉1h，洗滌后分別加入抗Notch1抗體(1∶500稀釋)、抗 Notch2抗體(1∶200稀釋)、抗 Notch3抗體(1∶400 稀釋)、抗 Notch4 抗體(1∶700稀釋)、抗 Hes－1抗體(1∶1000稀釋)、抗 Hes－5抗體(1∶1000稀釋)或抗GAPDH 抗體(1∶2000稀釋)(所有抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)，4℃孵育過(guò)夜。洗滌后加入抗兔或抗小鼠IgG－HRP(1∶2000稀釋)，室溫孵育2h。洗滌后利用化學(xué)發(fā)光法成像。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 使用商品化人 IL－22 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R＆D公司)對(duì)血漿和培養(yǎng)上清中IL－22表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 分選的CD4+T細(xì)胞使用佛波酯(終濃度50ng/mL)和伊烏諾霉素(終濃度1μg/mL)刺激培養(yǎng)12h，同時(shí)加入莫能霉素(終濃度10μg/mL)抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入FACS管中，加入抗CD4－APC(美國(guó)BD公司)進(jìn)行表面染色，4℃避光孵育20min，洗滌后加入破膜固定液孵育30min，然后加入抗IL－17－FITC(美國(guó)BD公司)和抗IL－22－PerCP(美國(guó)BD公司)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，室溫避光孵育30min，洗滌后加入含有4%多聚甲醛/PBS溶液固定，使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析，CellQuest Pro軟件獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo Version 8.4.2軟件分析結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先采用Shapiro－Wilk檢驗(yàn)對(duì)樣本的正態(tài)性進(jìn)行分析，所有樣本均符合正態(tài)分布。計(jì)量資料采用珋x±s表示，多組樣本間資料比較首先采用單因素方差分析，若存在差異再采用LSD－t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，DAPT刺激前后的資料比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)兩組資料進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞中Notch受體mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)的變化 健康對(duì)照、靜止期VKH綜合征和活動(dòng)期VKH綜合征患者間CD4+T細(xì)胞中Notch1 mRNA(F=238.8，P＜0.001)、Notch2 mRNA(F=183.7，P＜0.001)和 Notch3 mRNA(F=130.9，P＜0.001)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。活動(dòng)期VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞中Notch1、Notch2和Notch3 mRNA相對(duì)表達(dá)量較靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.313、0.162、0.376)。CD4+T細(xì)胞中Notch4 mRNA相對(duì)表達(dá)量在三組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.362，P=0.698)，見(jiàn)圖 1。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)健康對(duì)照和VKH綜合征患者Notch受體mRNA的表達(dá) A:Notch1;B:Notch2;C:Notch3;D:Notch4;bP＜0.001 vs健康對(duì)照和靜止期VKH。

進(jìn)一步檢測(cè)了 Notch1、Notch2、Notch3和 Notch4蛋白在6例活動(dòng)性VKH綜合征患者和5例健康對(duì)照志愿者CD4+T細(xì)胞中的水平。與mRNA相對(duì)表達(dá)量的趨勢(shì)相似，VKH綜合征患者 CD4+T細(xì)胞中 Notch1、Notch2和Notch3蛋白水平顯著高于健康對(duì)照，而Notch4蛋白水平在兩組之間無(wú)顯著差異(圖2)。

2.2 VKH綜合征患者血漿IL－22、CD4+T細(xì)胞中AhR和RORγt轉(zhuǎn)錄因子以及Th17、Th22細(xì)胞的變化 血漿IL－22在健康對(duì)照、靜止期VKH綜合征和活動(dòng)期VKH綜合征患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.6，P＜0.001，圖3)。活動(dòng)期 VKH綜合征患者血漿 IL－22(304.2±59.23pg/mL)顯著高于靜止期VKH綜合征患者(133.4±19.89pg/mL)和健康對(duì)照(140.2±23.47pg/mL)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.388)，且血漿IL－22水平與Notch受體mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著相關(guān)(P＞0.05)。健康對(duì)照、靜止期VKH綜合征和活動(dòng)期VKH綜合征患者間CD4+T細(xì)胞中Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AhR mRNA(F=224.2，P＜0.001)和 Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA(F=99.12，P＜0.001)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4?；顒?dòng)期VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞中AhR和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量較靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.234、0.242)。Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的流式檢測(cè)分析見(jiàn)圖5。健康對(duì)照、靜止期VKH綜合征和活動(dòng)期VKH綜合征患者Th22細(xì)胞(F=18.76，P＜0.001)和Th17細(xì)胞(F=22.04，P＜0.001)比例的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；顒?dòng)期VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞中Th22(3.38%±0.78%)和Th17細(xì)胞(5.51%±1.14%)比例較靜止期VKH綜合征患者(Th22:2.03%±0.63%;Th17:3.73%±0.86%)和健康對(duì)照(Th22:1.94%±0.81%;Th17:3.38%±0.72%)均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對(duì)照之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.725、0.236)。

圖2 Western blot檢測(cè)健康對(duì)照和活性期VKH綜合征患者Notch受體蛋白的表達(dá)。

2.3 抑制Notch信號(hào)通路對(duì)活動(dòng)性VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和分泌IL－22的影響 取106個(gè)從活動(dòng)性VKH綜合征患者分選的CD4+T細(xì)胞，加入DAPT刺激后，Notch信號(hào)通路下游分子Hes1和Hes5的表達(dá)顯著降低(圖6A)，提示DAPT有效抑制了Notch信號(hào)通路。AhR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(t=7.088，P＜0.001，圖6B)，但RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量在無(wú)DAPT刺激和DAPT刺激的CD4+T細(xì)胞中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.247，P=0.233，圖 6C)。DAPT刺激后 CD4+T細(xì)胞分泌IL－22的水平亦顯著降低(44.47±11.83pg/mL vs 78.87±9.63pg/mL;t=8.472，P＜0.001，圖 6D)。

3 討論

雖然VKH綜合征的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前的研究均認(rèn)為VKH綜合征是機(jī)體攻擊靶器官中的黑色素相關(guān)抗原所致的自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，VKH綜合征的發(fā)病與人類(lèi)白細(xì)胞抗原等位基因的多態(tài)性、IL－23受體的表達(dá)、固有免疫和適應(yīng)性免疫功能失調(diào)以及環(huán)境誘導(dǎo)的免疫失衡等多種免疫因素相關(guān)［9－11］。

圖3 ELISA檢測(cè)健康對(duì)照和VKH綜合征患者血漿IL－22的表達(dá) bP＜0.001 vs健康對(duì)照和靜止期VKH。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健康對(duì)照和VKH綜合征患者Th22和Th17細(xì)胞比例 A:流式檢測(cè)散點(diǎn)圖;B:Th22;C:Th17;bP＜0.001 vs健康對(duì)照和靜止期VKH。

Notch信號(hào)通路是一種高度保守的細(xì)胞信號(hào)通路，可影響細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，如多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞增殖和凋亡等［12］。Notch信號(hào)通路在眼部血管系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，參與多種與血管生成相關(guān)的眼病(如視網(wǎng)膜新生血管疾病、脈絡(luò)膜新生血管疾病)的發(fā)生發(fā)展［13］。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管退化中亦發(fā)揮調(diào)控作用［14］。但目前尚無(wú)Notch信號(hào)通路在VKH綜合征發(fā)病中的相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1、Notch2和Notch3 mRNA和蛋白在活動(dòng)性VKH綜合征CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，但在靜止期VKH綜合征患者中的表達(dá)則無(wú)明顯變化，提示Notch信號(hào)通路不但參與了VKH綜合征疾病的炎癥活動(dòng)，還說(shuō)明抑制機(jī)體免疫應(yīng)答可能降低了Notch受體的表達(dá)。雖然僅有Notch1、Notch2和Notch3的表達(dá)升高，Notch4的表達(dá)無(wú)顯著變化，而根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果，提示Notch2受體占優(yōu)勢(shì)。但Notch1～4介導(dǎo)的下游信號(hào)通路是相同的，因此Notch1、Notch2和Notch3的表達(dá)升高已足夠誘導(dǎo)下游信號(hào)分子的活化。但由于Notch信號(hào)通路具有重要且廣泛的免疫應(yīng)答調(diào)控功能，其在VKH綜合征發(fā)生發(fā)展中的免疫調(diào)控機(jī)制尚待深入研究。

圖6 DAPT刺激對(duì)活動(dòng)性VKH綜合征患者CD4+T細(xì)胞中Notch下游信號(hào)分子表達(dá)和AhR、RORγt mRNA及分泌IL－22的影響A:Hes1和Hes5蛋白表達(dá);B:AhR mRNA;C:RORγt mRNA;D:IL－22分泌;bP＜0.001 vs無(wú)DAPT刺激。

IL－22是一種具有雙重功能的細(xì)胞因子，其發(fā)揮促進(jìn)炎癥應(yīng)答或發(fā)揮免疫保護(hù)的功能取決于疾病類(lèi)型、病期以及 IL－22 所處的免疫微環(huán)境等［15］。在活動(dòng)性鞏膜炎［16］、自身免疫性非感染性葡萄膜炎［17］、干眼癥［18］患者的外周血或淚液中，IL－22的表達(dá)水平顯著升高;但在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的房水中，IL－22的水平卻未見(jiàn)明顯變化［19］。但尚未見(jiàn)有關(guān)IL－22在VKH綜合征患者中的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期VKH綜合征患者血漿IL－22、Th17和Th22細(xì)胞的水平顯著升高，但靜止期VKH綜合征患者IL－22、Th17和Th22細(xì)胞的水平與健康對(duì)照比較則無(wú)明顯變化，提示IL－22不但參與了VKH綜合征患者的機(jī)體炎癥應(yīng)答。還說(shuō)明抑制機(jī)體免疫應(yīng)答可能降低了IL－22的分泌。CD4+T細(xì)胞分泌IL－22主要由Notch信號(hào)通路調(diào)控，Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AhR參與了此過(guò)程，Notch－AhR－IL－22信號(hào)通路具有精細(xì)調(diào)控炎癥應(yīng)答作用［4］。因此，雖然本研究在活動(dòng)性VKH綜合征患者中未發(fā)現(xiàn)Notch受體與 IL－22表達(dá)存在明顯相關(guān)，但應(yīng)用DAPT抑制Notch信號(hào)通路卻顯著降低IL－22的表達(dá)，在此過(guò)程中，Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AhR表達(dá)降低，而Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)未受明顯影響，提示Notch信號(hào)通路可能主要影響Th22細(xì)胞分泌IL－22，而對(duì)Th17細(xì)胞分泌IL－22的功能無(wú)顯著影響，這與在慢性病毒性肝炎［5－6］、肺癌［20］中的研究結(jié)果一致。由于既往的研究發(fā)現(xiàn)，IL－23受體和Th17細(xì)胞在VKH綜合征中的水平均升高，促進(jìn)了 VKH 綜合征的疾病進(jìn)展［11，21］。IL－23 主要作用于Th17細(xì)胞，促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL－17和IL－22等細(xì)胞因子。因此，作為T(mén)h17細(xì)胞分泌的另外一種重要細(xì)胞因子，IL－22在VKH綜合征中很可能發(fā)揮促進(jìn)炎癥應(yīng)答、誘導(dǎo)疾病進(jìn)展的作用，而這一功能仍有待體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

總之，Notch－AhR－IL－22信號(hào)通路可調(diào)控VKH綜合征的炎癥應(yīng)答，參與了VKH綜合征的發(fā)病，促進(jìn)VKH綜合征的疾病進(jìn)展。Notch信號(hào)通路及IL－22的調(diào)控可能作為治療靶點(diǎn)，為VKH綜合征的治療提供新的思路。