莫加利，陳季旺,2,3,*，劉靜泊，舒 靜,2，廖 鄂,2,3，夏文水,3，程水源,4

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢輕工大學(xué)），湖北 武漢 430023；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4.國(guó)家富硒農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心，湖北 武漢 430023）

風(fēng)干武昌魚(yú)是通過(guò)自然風(fēng)干腌制武昌魚(yú)制作的一種發(fā)酵魚(yú)，是長(zhǎng)江中下游地區(qū)的一種傳統(tǒng)風(fēng)味魚(yú)制品[1]。通過(guò)酶和微生物的作用，魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物在腌制和風(fēng)干過(guò)程發(fā)生降解，形成風(fēng)干武昌魚(yú)特有的風(fēng)味。此外，風(fēng)干武昌魚(yú)中游離氨基酸種類(lèi)齊全，富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。

鮮味肽是指從食物中提取或者由氨基酸合成的低分子質(zhì)量的肽，不僅能賦予食品特殊的滋味，而且能改善風(fēng)味，提升味感[3-6]。科研人員從各種食品及動(dòng)植物蛋白酶解物中已分離和鑒定了大量的鮮味肽，并研究了這些鮮味肽的結(jié)構(gòu)與鮮味的關(guān)系[7-15]。超濾、凝膠過(guò)濾色譜、反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）常用于分離和純化鮮味肽，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier translation infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）等可用于測(cè)定鮮味肽的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)[4-5,9-14]。電子舌是基于非選擇性電化學(xué)傳感器陣列結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法建立起來(lái)的檢測(cè)體系。作為一種分析、識(shí)別和檢測(cè)復(fù)雜呈味物質(zhì)的儀器，電子舌具有快速、簡(jiǎn)便、安全、無(wú)疲勞等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[16-17]。

本課題組分析了風(fēng)干武昌魚(yú)的灰分、脂肪、蛋白質(zhì)和多肽含量、氨基酸和脂肪酸組成及揮發(fā)性成分[18]。有關(guān)風(fēng)干武昌魚(yú)中鮮味肽的分離純化和結(jié)構(gòu)分析的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用電子舌測(cè)定鮮味，以及超納濾、RP-HPLC從風(fēng)干武昌魚(yú)中分離純化出純度均一的鮮味肽，MALDI-TOF-MS、氨基酸自動(dòng)分析儀、FTIR測(cè)定鮮味肽的分子質(zhì)量、氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)，探討鮮味肽結(jié)構(gòu)與風(fēng)味的關(guān)系，以為風(fēng)干武昌魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風(fēng)干武昌魚(yú)（每條魚(yú)質(zhì)量約為258 g，水分40.64%、蛋白質(zhì)32.72%、脂肪9.40%、灰分9.38%、多肽4.26%）湖北興興食品有限公司；三氟乙酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、溴化鉀（分析純）、正己烷（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LG-3型冷凍干燥機(jī) 寧波市生化儀器廠；TS-5000Z電子舌 日本Insent公司；1500 HPLC儀 美國(guó)SSI公司；1525-2489 HPLC儀 美國(guó)Waters公司；HPS-3超濾膜、卷式芳香聚酰胺納濾膜 上海摩速有限公司；MALDI-TOF-MS儀 日本島津公司；NEXUS 670型FTIR儀 美國(guó)尼高力儀器公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 風(fēng)干武昌魚(yú)水溶性蛋白的提取

將風(fēng)干武昌魚(yú)去骨后用刀切成塊狀，加入去離子水，于勻漿機(jī)中12 000 r/min勻漿5 min，打碎混勻冷凍干燥后粉碎。取粉碎的魚(yú)肉100 g，正己烷脫脂后加入去離子水，在魚(yú)肉與水的比例1∶10（g/mL），溫度40 ℃，時(shí)間120 min條件下提取，4 000 r/min離心15 min，取上清液，真空濃縮、冷凍干燥，制得風(fēng)干武昌魚(yú)水溶性蛋白，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

1.3.2 超濾預(yù)分離、納濾脫鹽

室溫下使操作壓力為0.1 MPa，將風(fēng)干武昌魚(yú)水溶性蛋白用超純水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通過(guò)截留分子質(zhì)量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分離，收集濾過(guò)液和截留液，真空濃縮、冷凍干燥，-18 ℃冷凍貯藏，備用；室溫下使操作壓力為0.5 MPa，將電子舌測(cè)得超濾后鮮味較佳的組分用超純水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通過(guò)截留分子質(zhì)量約200 Da的納濾膜進(jìn)行納濾脫鹽，收集截留液，真空濃縮、冷凍干燥，制得納濾脫鹽組分，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

1.3.3 鮮味肽的理化成分測(cè)定

水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》105 ℃恒重法[19]；灰分含量測(cè)定：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》550～600 ℃灰化法[20]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法，轉(zhuǎn)換系數(shù)采用6.25[21]。

肽含量測(cè)定：采用雙縮脲法[22]。分別取4 mg超濾前水溶性蛋白、4 mg超濾后鮮味較強(qiáng)（未納濾）水溶性蛋白、4 mg納濾脫鹽水溶性蛋白置于試管中，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，于旋渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，然后4 000 r/min離心15 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并用5%的三氯乙酸溶液定容，搖勻。取6 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于旋渦混合儀上混合均勻，靜置10 min后2 000 r/min離心10 min。取上清液于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算超濾前組分、超濾后鮮味較強(qiáng)（未納濾）組分、納濾脫鹽組分中的多肽含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照雙縮脲法-常量法[22]。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg酪蛋白，以0.05 mol/L氫氧化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度約為5 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取出0、1、2、3、4、5 mL轉(zhuǎn)入6 支比色管，各加入4 mL雙縮脲試劑，并分別加入超純水補(bǔ)足到20 mL，于波長(zhǎng)550 nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

理化成分含量均按超濾前組分、超濾后鮮味較強(qiáng)（未納濾）組分、納濾脫鹽組分質(zhì)量計(jì)。結(jié)果以干基計(jì)。

1.3.4 RP-HPLC純化鮮味肽

選用超納濾分離得到的鮮味較強(qiáng)的肽組分，采用RP-HPLC進(jìn)一步純化，收集各組分，經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

RP-HPLC純化條件：SSI 1500 HPLC系統(tǒng)；Jupiter C18色譜柱（250 mm×10 mm）；SSI 1500紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速2 mL/min；樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL；進(jìn)樣體積1 mL；線性洗脫梯度：0～5 min，5% A；5～18 min，5%～15% A；18～20 min，15%～5% A。

1.3.5 電子舌分析

參照Z(yǔ)hang Meixiu等[14]的方法稍作改進(jìn)。分別將RP-HPLC純化的肽組分和超濾分離、納濾脫鹽的肽組分用超純水配成1 mg/mL的溶液80 mL，電子舌分析其滋味，選取鮮味較強(qiáng)的組分。

1.3.6 鮮味肽的純度鑒定

采用RP-HPLC鑒定鮮味較強(qiáng)的肽組分的純度，色譜條件如下：1525 HPLC系統(tǒng)；Jupiter C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；Waters 1489紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速1 mL/min；樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL；進(jìn)樣體積20 μL；線性洗脫梯度：0～2 min，5% A；2～10 min，5%～15% A；10～12 min，15%～5% A。

1.3.7 MALDI-TOF-MS測(cè)定分子質(zhì)量

樣品制備：稱(chēng)取約20 mg純化的肽組分，溶于100 μL水中。用20%乙腈溶液稀釋50 倍后，取0.5 μL點(diǎn)樣，進(jìn)行MALDI-TOF測(cè)試。

點(diǎn)樣：取1 μL供試品點(diǎn)至樣品靶上，自然干燥后，再取0.6 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。

校準(zhǔn)：在正離子模式下選擇反射方法對(duì)樣品測(cè)試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)范圍為：1 046.542±0.5、1 533.858±0.5、2 465.199±0.5、3 494.651±0.5。

測(cè)試樣品：在正離子模式下選擇線性方法測(cè)試樣品分子質(zhì)量。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)及圖譜處理：5800 MALDI-TOF/TOF產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導(dǎo)出。

1.3.8 氨基酸組成分析

采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定純化肽組分的氨基酸組成。取一定量的純化肽組分于玻璃試管中，加入15 mL 6 mol/L HCl溶液，試管抽真空，充氮?dú)夥夤?，置?08 ℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，待冷卻后，過(guò)濾，定容至100 mL，吸取濾液20 μL于40 ℃真空干燥器中進(jìn)行干燥，用0.2 mol/L HCl溶液定容至1 mL，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。結(jié)果以濕基計(jì)。

1.3.9 FTIR分析

參照Hasni等[23]的方法稍作改進(jìn)。采用FTIR分析純化肽組分的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用蘸取無(wú)水乙醇的脫脂棉將鑷子、研缽、壓片等用具擦試干凈，放在紅外燈下照射使無(wú)水乙醇快速揮發(fā)。在研缽中加入適量溴化鉀，按照質(zhì)量比約1∶100加入純化的肽組分，充分研磨至粉末狀混勻，壓片（壓片盡量薄而透明，以保證較高的透光率）。用FTIR測(cè)定紅外吸收光譜圖，以溴化鉀粉末作為空白背景，設(shè)定分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16 次，做全波長(zhǎng)（500～4 000 cm-1）掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以 ±s表示。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離組分的電子舌分析

圖1 超濾組分的電子舌雷達(dá)圖Fig. 1 Electronic tongue radar chart for the taste of ultrafiltration fractions

采用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜對(duì)風(fēng)干武昌魚(yú)水溶性蛋白進(jìn)行分離，得到分子質(zhì)量大于3 kDa、小于3 kDa 2 種組分，分別命名為P1、P2。電子舌分析超濾前組分、P1、P2的滋味，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，超濾前組分鮮味比P1強(qiáng)，因?yàn)槌瑸V前水溶性成分中有機(jī)酸、核酸及其他代謝產(chǎn)物，例如核苷酸、核糖等，對(duì)鮮味也有貢獻(xiàn)[24-27]。分子質(zhì)量小于3 kDa的組分（P2）鮮味較大于3 kDa的組分（P1）強(qiáng)，這與Lioea[28]、Claeys[29]等報(bào)道的風(fēng)味肽主要是分子質(zhì)量小于3 kDa的肽一致。因此，選取P2進(jìn)行納濾脫鹽及進(jìn)一步純化。

2.2 超濾、納濾組分的成分

表1 超濾、納濾肽組分的主要成分Table 1 Components of ultrafiltration and nano-filtration fractions%

將P2納濾脫鹽后得到組分P2a。由表1可知，超濾后組分（P2）中肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)由16.65%增加至50.77%，高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)、多肽等被截留，低分子質(zhì)量的肽被富集。從風(fēng)干武昌魚(yú)中提取的水溶性蛋白中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)非常高，達(dá)到了19.97%，超濾雖然去除了少量的灰分，但是P2中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍較高（17.84%），納濾后組分（P2a）中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由17.84%降低至9.82%，納濾脫鹽去除了組分P2中50%的灰分，達(dá)到了較好的脫鹽效果。

2.3 RP-HPLC純化鮮味肽

圖2 RP-HPLC純化鮮味肽的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of umami peptide purified by using RP-HPLC

由圖2A可知，P2a在保留時(shí)間20 min內(nèi)，線性梯度洗脫得到4 個(gè)在波長(zhǎng)220 nm有吸收峰的組分，分別標(biāo)注為P2a-1、P2a-2、P2a-3和P2a-4。由于RP-HPLC分離使疏水性弱（極性強(qiáng)）的物質(zhì)先被洗脫下來(lái)，初步判斷P2a-1、P2a-2的極性較強(qiáng)。分別收集4 個(gè)組分，經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后進(jìn)行電子舌分析。

從圖2B可以看出，P2a-2在波長(zhǎng)220 nm的洗脫圖譜中呈單一峰，純度高達(dá)95.20%，可用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。

2.4 RP-HPLC純化肽組分的電子舌分析

RP-HPLC純化的4 個(gè)組分（P2a-1、P2a-2、P2a-3、P2a-4）和P2a的電子舌分析結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知，5 個(gè)組分鮮味差別較大，P2a-3的鮮味最弱，其次是P2a-4、P2a-1和P2a，RP-HPLC純化的4 個(gè)組分中P2a-2鮮味強(qiáng)度最高。因此，選用P2a-2進(jìn)一步分析。

圖3 RP-HPLC純化鮮味肽的電子舌雷達(dá)圖Fig. 3 Electronic tongue radar chart of umami peptide purified by using RP-HPLC

2.5 P2a-2純度鑒定

圖4 P2a-2的MALDI-TOF-MS一級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 4 MALDI-TOF-MS spectrum of P2a-2

采用MALDI-TOF-MS測(cè)定鮮味肽P2a-2的質(zhì)量指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，P2a-2經(jīng)過(guò)激光輻照解離并扣除基質(zhì)的噪音干擾，在m/z 1 304.590 7出現(xiàn)明顯的峰，雜峰較少，說(shuō)明P2a-2純度較高，是分子質(zhì)量1 304.59 Da的肽，與RP-HPLC純度鑒定的結(jié)果一致（圖2B）。

2.6 氨基酸組成分析

構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸都屬L型，大部分L型氨基酸及其鹽具有酸味、甜味、苦味及鮮味，對(duì)食品風(fēng)味的形成有重要作用[24,30-32]。如表2所示，P2a、P2a-2的呈味氨基酸比例均較高，分別為71.79%、57.28%。P2a、P2a-2的呈味氨基酸中鮮味氨基酸谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量均較高，但是天冬氨酸含量較低。谷氨酸是呈現(xiàn)鮮味的特征酸性氨基酸，可以提供作為鮮味肽助味基的氨基或羥基，是呈現(xiàn)風(fēng)干武昌魚(yú)鮮美口感的重要氨基酸[24,30-32]。P2a-2中谷氨酸含量為21.97%，比P2a低1.3%，然而P2a-2的組氨酸含量（27.54%）比P2a高9.91%。Fuke等[33]研究表明組氨酸能夠增強(qiáng)風(fēng)味效果，促進(jìn)水產(chǎn)品鮮香味的形成，初步推斷P2a-2的鮮味比P2a強(qiáng)與組氨酸含量相差較大相關(guān)。另外，P2a-2中極性氨基酸組氨酸含量最高，與2.3節(jié)純化過(guò)程中顯示先被洗脫分離的組分P2a-2極性較強(qiáng)的結(jié)果一致。

表2 P2a、P2a-2的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of P2a and P2a-2%

2.7 FTIR分析

圖5 P2a、P2a-2的FTIR分析Fig. 5 FTIR spectra of P2a and P2a-2

如圖5所示，蛋白質(zhì)和多肽在紅外區(qū)域表現(xiàn)為9 個(gè)特征振動(dòng)模式或基團(tuán)頻率，但只有酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）是對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化高度敏銳的一個(gè)譜帶，常用于二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，因此選用酰胺I帶分析P2a、P2a-2二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異[12,23,34]。酰胺I帶的振動(dòng)頻率取決于C＝O和H—N之間的氫鍵性質(zhì)，酰胺I帶的波數(shù)在1 610～1 640 cm-1范圍內(nèi)為β-折疊，1 640～1 650 cm-1范圍內(nèi)為無(wú)規(guī)卷曲，1 650～1 658 cm-1范圍內(nèi)為α-螺旋，1 660～1 695 cm-1范圍內(nèi)為β-轉(zhuǎn)角[12,23,34]。P2a、P2a-2各子峰的面積百分比及歸屬見(jiàn)表3。

表3 P2a、P2a-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of the secondary structures of P2a and P2a-2

由表3可知，P2a二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量依次為：β-折疊49.31%、無(wú)規(guī)卷曲24.28%、α-螺旋20.55%、β-轉(zhuǎn)角5.86%；P2a-2二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量依次為：β-轉(zhuǎn)角90.16%、α-螺旋9.84%。P2a的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，P2a-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊是常見(jiàn)的規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角是部分規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)[24,30]。經(jīng)常出現(xiàn)在β-轉(zhuǎn)角中的氨基酸有天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸和谷氨酸等，以及影響規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的脯氨酸和甘氨酸[24,30]。脯氨酸的α-碳原子參與R基吡咯的形成，環(huán)內(nèi)的Cα—N鍵和C—N肽鍵都不能旋轉(zhuǎn)，而且脯氨酸形成的肽鍵不具酰胺氫，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，多肽鏈中只要存在脯氨酸，α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)即被中斷。然而，脯氨酸具有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和固定的φ角，在一定程度上能促使β-轉(zhuǎn)角的形成，因此，蛋白質(zhì)中脯氨酸含量高且分布均勻時(shí)，該蛋白的α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)缺乏，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量較高[24,30]。P2a-2的脯氨酸相對(duì)含量是P2a的1.4 倍，明顯高于P2a（表2），且組氨酸、谷氨酸含量均較高，利于β-轉(zhuǎn)角的形成。經(jīng)常出現(xiàn)在β-轉(zhuǎn)角中的谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸均屬于鮮味氨基酸，組氨酸屬于鮮味增強(qiáng)氨基酸，有利于P2a-2鮮味的形成，推斷P2a-2呈現(xiàn)鮮味與其二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主相關(guān)。

3 結(jié) 論

采用超濾分離、納濾脫鹽和RP-HPLC純化從武昌魚(yú)肉中純化得鮮味較佳單一肽組分P2a-2，MALDI-TOF-MS測(cè)定P2a-2的分子質(zhì)量為1 304.59 Da。P2a-2的鮮味氨基酸比例較高，二級(jí)結(jié)構(gòu)分別以β-轉(zhuǎn)角為主。經(jīng)常出現(xiàn)在β-轉(zhuǎn)角中的谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸均屬于鮮味氨基酸，組氨酸屬于鮮味增強(qiáng)氨基酸，有利于P2a-2鮮味的形成，推斷P2a-2呈現(xiàn)較佳鮮味與其鮮味氨基酸含量較高及二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主相關(guān)。該研究結(jié)果可用于指導(dǎo)風(fēng)干武昌魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。