吳曉琳，王 健，鄒立強(qiáng)*，嚴(yán) 持，劉 偉

（南昌大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

β-胡蘿卜素是最主要的類胡蘿卜素之一，屬于四萜類碳?xì)浠衔?，分子式為C40H56，相對分子質(zhì)量為536.88，是自然界最為普遍存在的天然色素。β-胡蘿卜素是VA的前體，是人體VA的主要來源，一個β-胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)相當(dāng)于兩個分子的VA[1-2]。β-胡蘿卜素具有抗氧化作用[3]，可加強(qiáng)生物機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能[4]以及加強(qiáng)細(xì)胞間的信號傳遞[5]。然而β-胡蘿卜素對光、熱、氧極為敏感，易發(fā)生降解、氧化、異構(gòu)化、光敏化反應(yīng)，應(yīng)用效益下降，因此β-胡蘿卜素應(yīng)避光、低溫、密封保存。再者，β-胡蘿卜素的弱極性分子結(jié)構(gòu)使得其溶解性較差，幾乎不溶于水，在室溫下只能微溶于油，這使得β-胡蘿卜素在運輸、儲存、應(yīng)用等方面受到了極大的限制。

為提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，運用食品級運載體系對其進(jìn)行包埋成為了近年來食品研究領(lǐng)域的一個熱點[6]。可用于包埋β-胡蘿卜素的運載體系有很多，如乳液[7]、脂質(zhì)體[8]、環(huán)糊精[9]、微膠囊[10]、分子復(fù)合物[11]等。乳液因其在制備工藝上較簡單、在經(jīng)濟(jì)上原料成本較合理，成為了研究最廣泛、應(yīng)用最多的β-胡蘿卜素運載體系。將β-胡蘿卜素包埋在乳液里，能提高β-胡蘿卜素的溶解度，還能保護(hù)其免受外界環(huán)境中不穩(wěn)定因素的影響，并提高其生物利用率[12]。但由于乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，油水界面存在較大的表面張力。隨著存放時間的推移，由于重力作用、兩相密度差、表面凈電荷不足等而發(fā)生分離、絮凝、聚結(jié)和奧氏熟化等作用，最終導(dǎo)致乳液破乳[13]。

水凝膠微粒是由三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生物高分子構(gòu)成的親水膠體微粒，其中三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)可以填充大量的水相成分，因此可以包埋一些小的水溶性的運載體系[14]。近年來研究最多且比較典型的是用水凝膠微粒包埋乳液油滴，因此水凝膠微粒被定義為一種以乳液為基礎(chǔ)的運載體系。水凝膠微粒包埋乳液油滴后相當(dāng)于形成了O/W1/W2結(jié)構(gòu)的乳液體系，其中O指乳液油滴，W1和W2指兩種不同的生物高分子形成的水相，通常體積比例較小的一相為內(nèi)水相（W1），體積比例較大的一相為外水相（W2）[15]。在相同油濃度的條件下，水凝膠微粒的物化特性與傳統(tǒng)乳液相比大不相同，如光學(xué)性質(zhì)、流變學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性和釋放特性。而微粒的大小、分布情況、乳液油滴在水凝膠內(nèi)的空間位置以及水凝膠微粒的特性都依賴于所選擇的生物高分子材料及制備方法。

本研究以酪蛋白為乳化劑制備β-胡蘿卜素乳液，再通過凝聚法以酪蛋白和海藻酸鈉為原料制備β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒，并加入不同濃度的Ca2+進(jìn)行交聯(lián)，分析對比Ca2+交聯(lián)后的β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的理化性質(zhì)的變化，考察Ca2+交聯(lián)對β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒離心穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、離子穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性的影響，為提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性提供一定的依據(jù)，并對構(gòu)建高品質(zhì)的乳液型運載體系和制備高品質(zhì)乳液基食品具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素（C110501） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；玉米油 益海嘉里南昌糧油食品有限公司；酪蛋白酸鈉（C8654）、海藻酸鈉（180947）、尼羅紅、尼羅藍(lán)A均 Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；氯化鈉、乙醇、正己烷、疊氮化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T18分散機(jī) 德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；M-110動態(tài)高壓微射流 美國Microfluidic公司；Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Mastersizer 3000粒度儀、zs90電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；LSM710共聚焦顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；XW-80A旋渦混勻器 上海精科實業(yè)有限公司；HH-S26恒溫水浴鍋 金壇市梅香儀器有限公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司；EX1103ZH電子分析天平 西杰天平（北京）儀器有限公司；TDL-5-A臺式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；LRHS-250B恒溫培養(yǎng)箱 上海左樂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的制備

溶液的配制：配備0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：2.184 6 g/L Na2HPO4·12H2O，0.608 4 g/L NaH2PO4·2H2O；2 g/100 mL的酪蛋白溶液：稱取一定量的酪蛋白溶解于PBS中，并加入0.01%的疊氮化鈉抑菌，不斷攪拌直至完全溶解，并置于冰箱中過夜使其充分水合；2 g/100 mL的海藻酸鈉溶液：稱取一定量的海藻酸鈉溶解于PBS中，并加入0.01%的疊氮化鈉抑菌，不斷攪拌直至完全溶解，并置于冰箱中過夜使其充分水合。

β-胡蘿卜素乳液的制備參考Yi Jiang等[16]方法：將一定量的β-胡蘿卜素（0.5 g/100 mL）溶于玉米油中，超聲并不斷攪拌使其完全溶解。將油相與蛋白相（酪蛋白溶液）按照1∶9的質(zhì)量比混合，并用高速分散機(jī)在22 000 r/min分散2 min，然后立刻用高壓微射流（壓力為120 MPa）均質(zhì)3 次。最終得到β-胡蘿卜素乳液。

β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的制備參考Zhang Zipei等[15]的方法：將所制備好的β-胡蘿卜素乳液與2 g/100 mL的酪蛋白溶液以體積比1∶1的比例混合，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?00 r/min）。再將所得到的體系與2 g/100 mL海藻酸鈉溶液以體積比1∶2的比例混合，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?00 r/min）。最后，用1 mol/L的檸檬酸溶液將混合體系的pH值調(diào)至4.5，磁力攪拌（500 r/min）30 min。最終形成β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒。

Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的制備：配備0.01 mol/L的CaCl2溶液，并用其作為母液，用于交聯(lián)水凝膠微粒。最終使得水凝膠微粒中Ca2+濃度分別達(dá)到1、2、4 mmol/L，即得到不同交聯(lián)度的β-胡蘿卜素水凝膠微粒，并進(jìn)行相應(yīng)的考察。

1.3.2 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的Zeta電位、平均粒徑以及包埋率的測定

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒分別用相應(yīng)pH值的緩沖溶液稀釋100 倍后，用馬爾文動態(tài)光散射儀測定Zeta電位。測試參數(shù)為：溫度25 ℃，折光率1.333，外部光纖角度18.9°，散射角度14.0636°。

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒的粒徑使用馬爾文激光粒度儀測定。用蒸餾水作為分散介質(zhì)，設(shè)置分析條件為：顆粒（玉米油）折射率1.472，顆粒吸收率0.100，分散劑（水）折射率1.33，激光遮光度10%左右。粒徑的大小用加權(quán)平均體積直徑（d32）表示：

式中：ni為粒徑為di的顆粒數(shù)目。

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒中β-胡蘿卜素的包埋率的測定參考Surh等[17]的方法并調(diào)整。取樣品1 mL，加入正己烷3 mL，在旋渦混勻儀上充分振蕩混合均勻后，于10 000×g離心5 min。取上清液于容量瓶中定容，并用紫外-可見分光光度計在波長450 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出β-胡蘿卜素的含量，包埋率用公式（2）計算：

1.3.3 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的微觀結(jié)構(gòu)

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒的微觀結(jié)構(gòu)采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行考察，參照Chung等[18]的方法并進(jìn)行調(diào)整。分別稱取一定量的尼羅紅和尼羅藍(lán)溶于酒精，形成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的染料。取2 mL樣品分別加入0.1 mL的尼羅紅染料和尼羅藍(lán)染料，混合均勻。其中，樣品中的蛋白相被尼羅藍(lán)染色，油相被尼羅紅染色。樣品染色以后，加入到表面皿上，放置在激光共聚焦顯微鏡后，采用10 倍目鏡和60 倍物鏡，并設(shè)置顯微鏡的激發(fā)波長和吸收波長與相應(yīng)的染料對應(yīng)，并進(jìn)行觀察拍照。

1.3.4 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的流變性質(zhì)

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒的流變學(xué)性質(zhì)分析參考Soukoulis等[19]的方法，利用DHR-2Discovery流變儀對樣品進(jìn)行流變學(xué)性質(zhì)的研究。測試前將乳液及水凝膠微粒分別于1 000 r/min攪拌30 min，以保證沒有氣泡，并于4 ℃放置18 h以達(dá)到平衡。測試使用剪切掃描，使用40 mm夾具，夾具與載物臺之間間距1 mm，在室溫25 ℃，以剪切應(yīng)力從0.1～500 s-1記錄每個樣品的流動曲線。

1.3.5 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性

將β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒分別稀釋100 倍后，在2 500 r/min離心5 min，用注射器吸取離心后的底層部分，用紫外-可見分光光度計在600 nm波長處測其吸光度；同時，對經(jīng)稀釋未離心的乳液及水凝膠微粒取樣，同樣在600 nm波長處測定吸光度。離心穩(wěn)定性用離心穩(wěn)定性常數(shù)[20]表示，計算公式如下：

式中：K為離心穩(wěn)定性常數(shù)/%；A1為樣品離心前的吸光度；A2為樣品離心后底層溶液的吸光度。

1.3.6 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的pH值穩(wěn)定性

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒的pH穩(wěn)定性的測定參照Zhang Zipei等[21]的方法。將每組樣品稀釋至含等量的β-胡蘿卜素，用1 mol/L氫氧化鈉溶液或檸檬酸溶液將樣品溶液的pH值分別調(diào)至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，分別取溶液約5 mL，分裝于試管中。靜置24 h，用1.3.2節(jié)法測其粒徑變化，并進(jìn)行拍照。

1.3.7 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的離子穩(wěn)定性

β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒的離子穩(wěn)定性的測定參照文獻(xiàn)[21]的方法。將每組樣品稀釋到含等量的β-胡蘿卜素，用6 mol/L氯化鈉溶液將樣品溶液的離子濃度分別調(diào)到0.5、1、2、3、4 mol/L，于各離子濃度下分別取溶液約5 mL，分裝于試管中。靜置24 h，用1.3.2節(jié)方法測其粒徑變化，并進(jìn)行拍照。

1.3.8 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的貯藏穩(wěn)定性

將β-胡蘿卜素乳液及不同交聯(lián)度的水凝膠微粒稀釋到含等量的β-胡蘿卜素，分裝在離心管中，密封避光保存在25 ℃和37 ℃，間隔取樣，測定樣品中β-胡蘿卜素含量。β-胡蘿卜素含量的測定參照Liu Fu等[22]的方法：每個樣品取0.5 mL，分別加入2 mL的乙醇和3 mL的正己烷，于旋渦混勻器上振蕩，使樣品充分破乳溶解，再靜置數(shù)分鐘使正己烷相和乙醇相充分分離，吸取并收集萃取液（正己烷相）。繼續(xù)添加3 mL正己烷進(jìn)行振蕩萃取兩次，合并萃取液。定容后，吸取萃取液，用紫外-可見分光光度計在波長450 nm處測定其吸光度。并結(jié)合β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品中β-胡蘿卜素的濃度，計算β-胡蘿卜素的保留率：

式中：Ct為貯藏相應(yīng)溫度下第t天的濃度；C0為最初樣品中β-胡蘿卜素的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)都進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)分析和圖表分析采用Origin 8.0軟件，結(jié)果表示為 ±s。實驗數(shù)據(jù)之間的顯著性差異借助SPSS 18.0進(jìn)行Duncan檢測，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的制備

參考Yi Jiang[16]和Zhang Zipei[15]等的方法制備得到β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒，向其中滴加Ca2+使得水凝膠微粒中的Ca2+濃度分別為0、1、2、4 mmol/L，并分別記為FHP-0、FHP-1、FHP-2、FHP-4。海藻酸鈉分子由α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）通過（1→4）糖苷鍵聚合而成，其中的G片段會通過協(xié)同作用結(jié)合形成鉆石形的親水空間，而Ca2+會占據(jù)這些親水空間，并與G片段上的O原子發(fā)生螯合作用形成配位鍵[23]。如圖1所示，本研究利用Ca2+和海藻酸鈉的相互作用，在溶液中加入少量Ca2+交聯(lián)水凝膠微粒，以期能獲得更為穩(wěn)定的體系。

圖1 鈣交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒制備示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation process of Ca2+ crosslinked β-carotene-loaded emulsion hydrogel microparticles

2.2 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的Zeta電位、平均粒徑與包埋率測定

如表1所示，隨著Ca2+濃度的增加，水凝膠微粒的粒徑有變小的趨勢，而電位有所增大，但是這種趨勢不明顯，顯著性分析表明FHP-0、FHP-1、FHP-2、FHP-4之間的粒徑大小和電位均無顯著性差異。這種不明顯的趨勢是由于所使用的Ca2+濃度較小，同時也證明所使用的Ca2+濃度范圍不會破壞水凝膠微粒的結(jié)構(gòu)。而海藻酸鈉和Ca2+結(jié)合后，分子鏈蜷縮形成“蛋盒”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致水凝膠微粒的粒徑減小，并且隨著Ca2+濃度的增加，海藻酸鈉分子鏈和Ca2+交聯(lián)程度越大，形成的水凝膠微粒的結(jié)構(gòu)越緊密，因此粒徑也會隨之減少。水凝膠微粒與乳液對β-胡蘿卜素的包埋率都比較高（97.39%以上），且沒有顯著性差異。這是由于β-胡蘿卜素負(fù)載在乳液液滴中，水凝膠微粒對乳液油滴的雖然包裹更加緊湊，但并不會影響β-胡蘿卜素的包埋率。此外Ca2+交聯(lián)也不會顯著影響β-胡蘿卜素包埋率。

表1 不同鈣離子濃度交聯(lián)水凝膠微粒的平均粒徑與電位以及包埋率Table 1 Mean particle size, zeta-potential and entrapment efficiency of cross-linked hydrogel microparticles with different Ca2+ concentrations

2.3 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的微觀結(jié)構(gòu)

β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒微觀結(jié)構(gòu)采用激光共聚焦顯微鏡觀察。其中蛋白相（尼羅藍(lán)A染色）呈現(xiàn)綠色，油相（尼羅紅染色）呈現(xiàn)紅色，兩相重疊呈現(xiàn)黃色。圖2顯示，在β-胡蘿卜素乳液共聚焦圖中，油滴布滿了整個圖像，隱約可觀察到一個個的小顆粒。這是由于乳液的粒徑太小，已經(jīng)接近激光共聚焦的最低的分辨率，其他研究者也遇到類似的問題[24]。而在β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的共聚焦圖中，可清晰地看到比較大的顆粒，呈不規(guī)則球形狀，并且油相（紅色）和蛋白相（綠色）都出現(xiàn)在水凝膠微粒里面。這表明水凝膠微粒成功地包埋住了乳液油滴，這與其單峰粒徑分布圖符合。

從圖2還可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HP-0、FHP-1、FHP-2及FHP-4的粒子大小和形狀無明顯不同，但是隨著Ca2+濃度的增加，可明顯看到圖像中所能觀察到的粒子數(shù)目越多。這些現(xiàn)象與表1的粒徑分布相符合，進(jìn)一步說明Ca2+的加入會促進(jìn)水凝膠微粒的形成。

圖2 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒的共聚焦圖Fig. 2 Confocal photomicrograph of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles

2.4 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的流變性質(zhì)

根據(jù)流變曲線形狀，可以將流體分為牛頓流體和非牛頓流體兩類[25]。非牛頓流體的黏度不僅受溫度的影響，還受到剪切速率和剪切應(yīng)力的影響，又可分為塑性流體、假塑性流體及膨脹型流體等主要類型。由圖3可以看出，乳液的黏度隨著剪切速度的增加呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢，總體呈現(xiàn)下降趨勢，而水凝膠微粒的黏度隨著剪切速率的增加而下降。乳液及水凝膠微粒均發(fā)生了剪切變稀現(xiàn)象，屬于假塑性流體。水凝膠微粒的黏度高于乳液的黏度，且隨著Ca2+濃度的增加而增加。隨著Ca2+濃度的增加，Ca2+在海藻酸鈉分子間建立的橋聯(lián)越多，溶液的凝膠強(qiáng)度會增加，即黏度會增加。將β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒（FHP-0、FHP-1、FHP-2、FHP-4）樣品瓶倒置（圖4），可以看到溶液掛壁現(xiàn)象逐漸明顯，F(xiàn)HP-4已經(jīng)明顯變成凝膠狀態(tài)，倒置時不會下流。加入Ca2+交聯(lián)水凝膠微粒不僅會促進(jìn)水凝膠微粒的形成，同時也會導(dǎo)致水凝膠微粒形成凝膠。

圖3 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒的剪切速率-黏度曲線Fig. 3 Shear rate viscosity curves of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles

圖4 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒的外觀圖Fig. 4 Appearance of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles

2.5 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性

將乳液及水凝膠微粒在一定轉(zhuǎn)速下離心一段時間可以加速乳液的分層，故離心穩(wěn)定性可以用來判定樣品自然靜置長時間后的狀態(tài)變化。乳液型運載體系維持其物理穩(wěn)定的能力不僅取決于油相和水相的密度差，同時取決于油水相之間界面膜的穩(wěn)定性[26]。由圖5可以看出，β-胡蘿卜素乳液的離心穩(wěn)定性常數(shù)較β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒（FHP-0）低，說明乳液具有更佳的離心穩(wěn)定性。在β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒（FHP-0）中，油相和水相的密度差更大，在外界離心力的作用下更易分層。但是隨著Ca2+濃度的增加，水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性常數(shù)變小，趨向穩(wěn)定。其中，F(xiàn)HP-1的離心穩(wěn)定性和乳液不相上下，而FHP-2及FHP-4的離心穩(wěn)定性均優(yōu)于乳液。這表明，Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒，能夠降低油水相間的界面張力，提高界面膜穩(wěn)定性。

圖5 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性Fig. 5 Centrifugal stability of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles

2.6 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的pH值穩(wěn)定性

圖6 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒在不同pH值的外觀圖Fig. 6 Appearance of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles at different pH values

由圖6可以看出，β-胡蘿卜素乳液在pH 5.5～7時外觀均一穩(wěn)定，而在pH 3～5時發(fā)生了嚴(yán)重的分層現(xiàn)象，說明pH值對β-胡蘿卜素乳液的穩(wěn)定性有較大影響，β-胡蘿卜素乳液在酸性pH值下極其不穩(wěn)定。同時，結(jié)合β-胡蘿卜素乳液在不同pH值下的粒徑（圖7）可以看出，乳液在pH 5.5～7時粒徑都較小，集中在0.476 μm左右，而在pH 3～5時顯著增大（大于20 μm），進(jìn)一步說明了β-胡蘿卜素乳液的穩(wěn)定性對pH值的依賴性。這主要是因為乳液油滴在酪蛋白等電點附近時帶的電荷量較少，難以形成靜電排斥力導(dǎo)致乳液油滴發(fā)生聚集現(xiàn)象[27]。

水凝膠微粒在pH 3～7時外觀都均一穩(wěn)定，只有FHP-2和FHP-4在pH 3時發(fā)生了略微的分層現(xiàn)象（圖6），說明pH值對β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的穩(wěn)定性影響很小，β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒在pH 3～7的范圍內(nèi)都較穩(wěn)定。從圖7可以發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的粒徑在pH 4～5.5的范圍內(nèi)不變，而在pH 3～3.5時略微的增大，在pH 6～7時有變小的趨勢。其中，水凝膠微粒的粒徑的增大（pH 3～3.5），這是因為在該pH值范圍內(nèi)，海藻酸鈉帶微弱負(fù)電而乳液油滴帶正電，由于弱靜電吸引作用導(dǎo)致水凝膠微粒發(fā)生溶脹現(xiàn)象，并且Ca2+的加入會促進(jìn)水凝膠微粒的溶脹。pH 6～7時，水凝膠微粒的粒徑減小，這是因為在此pH值范圍內(nèi)，海藻酸鈉和乳液油滴同時帶負(fù)電荷，由于靜電排斥力導(dǎo)致出現(xiàn)水凝膠微粒分解釋放出乳液油滴的現(xiàn)象，且Ca2+的加入會延緩水凝膠微粒的分解。由此可見，水凝膠微粒能夠適應(yīng)的pH值范圍更寬泛，較乳液而言，水凝膠微粒能在pH 3～7能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖7 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒在不同pH值條件下的粒徑Fig. 7 Mean particle diameters (d32) of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles at different pH values

2.7 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的離子穩(wěn)定性

如圖8所示，β-胡蘿卜素乳液在NaCl濃度0～4 mol/L時，外觀都均一穩(wěn)定。結(jié)合圖9，隨著鹽濃度的增加，β-胡蘿卜素乳液的粒徑無較大變化，可見β-胡蘿卜素乳液的穩(wěn)定性不依賴于離子濃度。然而有不少研究發(fā)現(xiàn)其所制備酪蛋白乳液的離子穩(wěn)定性較差，在高鹽濃度下會出現(xiàn)失穩(wěn)分層現(xiàn)象[28-29]。這種現(xiàn)象差異主要是由于酪蛋白是一種全價含磷蛋白質(zhì)，主要由αS1-、αS2-、β-、κ-酪蛋白這4 種類型蛋白組成，且其鹽的穩(wěn)定性主要受到αS1-酪蛋白及β-酪蛋白比例的影響，此外還會受到酪蛋白濃度的影響[30-32]。

由圖8可以看出，F(xiàn)HP-0和FHP-1在NaCl濃度為3 mol/L和4 mol/L時均發(fā)生分層現(xiàn)象，其余濃度下都均一穩(wěn)定。結(jié)合粒徑圖（圖9），可發(fā)現(xiàn)FHP-0和FHP-1的粒徑在NaCl濃度增加到2 mol/L時會有所增大，并隨著NaCl濃度的增加而增大，而FHP-2和FHP-4的粒徑一直維持不變。不同濃度的NaCl會產(chǎn)生不同的靜電屏蔽效應(yīng)，影響蛋白和多糖之間的靜電相互作用[33]。Ca2+交聯(lián)濃度為0～2 mmol/L時，水凝膠微粒在NaCl濃度高于2 mol/L時，受到靜電屏蔽的作用而發(fā)生解離，因此發(fā)生分層現(xiàn)象。而當(dāng)Ca2+交聯(lián)濃度為2～4 mmol/L，水凝膠微?？梢栽诓煌腘aCl濃度下一直保持穩(wěn)定，并沒有在高離子強(qiáng)度時發(fā)生解離，表明Ca2+的增加會加強(qiáng)蛋白和多糖之間的作用力，能提高水凝膠微粒的離子穩(wěn)定性。

圖8 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒在不同鹽濃度的外觀圖Fig. 8 Appearance of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles at different salt concentrations

圖9 β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微粒在不同鹽濃度下的粒徑Fig. 9 Mean particle diameters (d32) of β-carotene-loaded emulsion and hydrogel microparticles at different salt concentrations

2.8 Ca2+交聯(lián)β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的貯藏穩(wěn)定性

本研究測定在兩個不同的貯藏溫度（25 ℃和37 ℃）下β-胡蘿卜素的保留率，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，于25 ℃貯藏第42天時，乳液中β-胡蘿卜素的保留率約為2%，而水凝膠微粒中β-胡蘿卜素的保留率達(dá)30%以上；于37 ℃貯藏第24天時，乳液中β-胡蘿卜素基本全部被降解，而水凝膠微粒中β-胡蘿卜素仍達(dá)25%以上。且水凝膠微粒經(jīng)Ca2+交聯(lián)后，對水凝膠微粒中β-胡蘿卜素的保護(hù)效果有略微的提高作用。

據(jù)報道，β-胡蘿卜素在酸性環(huán)境中更易降解[34-35]。因此，水凝膠微粒（pH 4.5）中的β-胡蘿卜素比乳液（pH 7.0）有更高的保留率，可認(rèn)為并非因環(huán)境pH值差異而導(dǎo)致的。在水凝膠微粒中，β-胡蘿卜素乳液油滴是被由酪蛋白和海藻酸鈉組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)給包圍著，可阻礙氧、氧化劑、自由基的滲入，從而降低了β-胡蘿卜素的降解率[30]。酪蛋白是一種具有抗氧化作用的蛋白，它能夠清除自由基和螯合重金屬[36]。而在水凝膠微粒結(jié)構(gòu)中，β-胡蘿卜素乳液油滴是被酪蛋白酸鈉分子簇?fù)碇?，也就是?胡蘿卜素處在更高抗氧化劑濃度的環(huán)境中。研究表明，胡蘿卜素的氧化降解反應(yīng)是一個界面反應(yīng)，界面面積越小，則反應(yīng)速率越慢[37]。相對于乳液而言，擁有較大粒徑的水凝膠微粒，其界面表面積更小，因而在相同的貯藏過程下，水凝膠微粒有較高的β-胡蘿卜素保留率。綜上所述，水凝膠微粒對β-胡蘿卜素的保護(hù)效果更好。而用Ca2+交聯(lián)水凝膠微粒，不僅可以促進(jìn)水凝膠微粒的形成，還可以提高溶液的黏度，隨著溶液黏度的增加，可以進(jìn)一步減少氧化劑的攝入，從而進(jìn)一步提高對β-胡蘿卜素的保護(hù)。

圖10 25 ℃（A）和37 ℃（B）貯藏過程中乳液及水凝膠微粒中β-胡蘿卜素的保留率Fig. 10 Retention of β-carotene in emulsion and hydrogel microparticles during storage at 25 ℃ (A) and 37 ℃ (B)

3 結(jié) 論

本研究通過乳化法得到了以酪蛋白為原料、粒徑約為0.476 μm的β-胡蘿卜素乳液，并加入一定比例的海藻酸鈉，再調(diào)節(jié)溶液的pH值，采用靜電凝聚法成功構(gòu)建了粒徑約為1.87 μm的β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒，最后加入濃度分別為0、1、2、4 mmol/L的Ca2+交聯(lián)水凝膠微粒。并考察了鈣交聯(lián)對β-胡蘿卜素乳液及水凝膠微?；拘再|(zhì)及穩(wěn)定性（離心穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、離子穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性）的影響。經(jīng)Ca2+交聯(lián)后的水凝膠微粒粒徑有略微變小的趨勢，電位有略微變大的趨勢，對β-胡蘿卜素的包埋率較乳液大；從微觀結(jié)構(gòu)分析表明，加入Ca2+后的水凝膠微粒的大小無明顯變化，但是隨著Ca2+的增加，水凝膠微粒離子的數(shù)目增加，說明Ca2+的加入有促進(jìn)水凝膠形成的作用；β-胡蘿卜素乳液及β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒均屬于剪切變稀的假塑性流體，隨著Ca2+的增加，水凝膠微粒的黏度增加，凝膠強(qiáng)度增加；未經(jīng)Ca2+交聯(lián)的β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性比乳液差，但是Ca2+交聯(lián)后，水凝膠微粒的離心穩(wěn)定性得到提高，甚至優(yōu)于乳液；β-胡蘿卜素乳液會在pH 3～5發(fā)生分層現(xiàn)象，而β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒在pH 3～7之間都相對較穩(wěn)定，Ca2+的加入會促進(jìn)水凝膠微粒的溶脹，且延緩水凝膠微粒的分解；β-胡蘿卜素乳液可以在高NaCl濃度下一直保持穩(wěn)定，Ca2+交聯(lián)濃度為0～2 mmol/L的β-胡蘿卜素乳液水凝膠微粒在高NaCl濃度（2 mol/L以上）時會分層現(xiàn)象，但是Ca2+交聯(lián)濃度為2～4 mmol/L的β-胡蘿卜素乳液水凝膠微?？梢栽诓煌琋aCl濃度下一直保持穩(wěn)定；在貯藏穩(wěn)定性實驗中，測得水凝膠微粒中β-胡蘿卜素的保留率更高，而經(jīng)Ca2+交聯(lián)后，可以進(jìn)一步提高對β-胡蘿卜素的保護(hù)。