史 穎，張健煜，唐 逸，張廣慧，何明利

0 引 言

急性缺血性卒中占全部腦卒中的70%～80%［1-2］，血管再通（動靜脈溶栓和/或機(jī)械取栓）是目前最直接、有效的治療方法［3］，然而真正從中獲益的患者不到總發(fā)病人數(shù)的5%［4］。此外，恢復(fù)缺血區(qū)血流灌注后可引起缺血再灌注損傷（cerebralischemiareperfusioninjury，CIRI），其涉及多種病理生理變化，呈現(xiàn)時間、空間上的動態(tài)改變。

內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是由32個氨基酸組成的內(nèi)源性肽，具有強(qiáng)烈的收縮血管作用。內(nèi)皮素受體（Endothelin receptor，ETR）屬G蛋白耦聯(lián)受體，包含兩種亞型：ETRA、ETRB。生理狀態(tài)下，ET-1與ETRA結(jié)合所介導(dǎo)的血管平滑肌收縮效應(yīng)，和與ETRB結(jié)合所介導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)相互均衡，以維持正常血管張力，維持腦血管自動調(diào)節(jié)功能［5］。腦缺血后，ET-1亦在其病理生理過程中發(fā)揮重要作用［6］。

已有學(xué)者提出，腦梗死患者血漿ET-1水平顯著增高，并與腦缺血發(fā)作的持續(xù)時間和強(qiáng)度密切相關(guān)［7-9］。然而，缺血后腦內(nèi)ET-1、ETR的含量變化和空間分布特征尚未澄清，闡明此問題有利于進(jìn)一步明確ET-1與腦缺血后相關(guān)腦損傷的關(guān)系。因此，本研究制備短暫性大腦中動脈閉塞（（transientMCAO，tMCAO）/再灌注模型，基于前期實驗選取典型時間點再灌注12h，觀測其梗死半球多個腦區(qū)的ET-1、ETRA和ETRB表達(dá)水平變化與部位分布特征，為后續(xù)相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組清潔級雄性SD大鼠12只，體重230～260 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（蘇）2017-0007。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24℃，相對濕度50%，12 h自然晝夜循環(huán)，保持通風(fēng)，自由攝食、飲水。依照前期實驗結(jié)果，梗死半球內(nèi)ET-1、ETR含量于再灌注12 h較假手術(shù)組含量明顯增高，因此我們選取再灌注12 h作為典型時間點，以探討缺血再灌注后腦內(nèi)ET-1、ETR于腦內(nèi)的分布情況。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、缺血再灌注組，每組6只。。

1.2 tMCAO模型制備采用大腦中動脈管腔內(nèi)閉塞法制備tMCAO模型［10］。10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒頸部皮膚，沿頸正中作一切口，外科顯微鏡下分離暴露左頸總動脈（left common carotid artery，LCCA）、左側(cè)頸內(nèi)動脈（left internal carotid artery，LICA），左側(cè)頸外動脈（left external carotid artery，LECA）。血管夾暫時夾閉LICA和LCCA，將前端用火燒鈍的4.0號尼龍線線栓經(jīng)LECA上的切口向前推進(jìn)插入LICA，直至感覺到輕度阻力。2 h后大鼠麻醉狀態(tài)下抽出線栓，再灌注開始。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)操作與缺血再灌注組相似，但LICA不插入線栓。實驗動物清醒后自由飲食飲水。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 腦組織切片制備將各組大鼠麻醉后由劍突下剪開皮膚，逐步向上剪開膈肌，充分暴露心臟，經(jīng)左心室向主動脈插入針頭，心臟充盈后剪開右心耳。灌注200 mL等滲鹽水，待肝逐漸變白后，再以4%多聚甲醛200 mL灌注直到全身僵硬。迅速斷頭取腦，置入4%多聚甲醛液中，4℃冰箱內(nèi)固定2～3 d，取出腦組織PBS沖洗3次，每次10 min，行梯度脫水：50%乙醇30 min，60%乙醇60 min，70%乙醇120 min，80%乙 醇 180 min，90%乙 醇 180 min，100%乙醇中180 min（分2次，每次90 min）。脫水畢兩次透明：將腦組織置二甲苯中，每次10 min。然后浸蠟：取出腦組織放置于恒溫箱60～70℃的液體石蠟中3～4 h。浸蠟完畢后包埋蠟塊，將修好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)中進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，切片厚5 μm，防脫片載玻片撈片，室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫組化染色二甲苯脫蠟-梯度乙醇復(fù)水-蒸餾水、PBS溶液各5 min、3%過氧化氫溶液10 min、PBS溶液洗3次（5 min/次）、檸檬酸鹽緩沖液煮沸12 min、PBS溶液洗3次（5 min/次）、5%-BSA室溫封閉1 h、羊抗Endothelin A receptor多克隆抗體（1∶100，美國Abcam公司，ab30536）/鼠抗Endothelin 1單克隆抗體（1∶50，美國Abcam公司，ab2786）4℃過夜、PBS溶液洗3次（10 min/次）、二抗室溫1h、PBS溶液洗3次（10 min/次）、DAB顯色，鏡下觀察，適時終止。 PBS溶液洗3次（5 min/次）、蘇木精30 s、自來水洗10 min、乙醇梯度脫水（85%20 s、90%30 s、95%1 min、100%2 min）、二甲苯透明后中性樹膠封固、光鏡觀察。免疫組化圖片使用Image pro plus軟件進(jìn)行圖像采集及存檔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ± s）表示。2組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠 ET-1的表達(dá)縱觀各腦區(qū)ET-1主要表達(dá)于缺血半球的皮層、尾殼核和海馬，ET-1陽性表達(dá)區(qū)呈棕褐色，見圖1。大鼠大腦皮層、尾殼核和海馬中ET-1的表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增高（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠大腦中ETRA的表達(dá)腦缺血后再灌注中ETRA選擇性表達(dá)于梗死半球腦室脈絡(luò)叢、軟腦膜血管、大腦中動脈，陽性表達(dá)區(qū)呈棕褐色，見圖2。缺血再灌注組脈絡(luò)叢、軟腦膜血管和大腦中動脈中ETRA的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），見表1。

圖1 各組大鼠大腦梗死半球不同腦區(qū)ET-1的表達(dá)（免疫組化染色×200）Figure 1 Expression of ET-1 in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

圖2 各組大鼠大腦梗死半球不同腦區(qū)ETRA的表達(dá)（免疫組化染色×200）Figure 2 Expression of ETR-A in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

2.3 各組大鼠 ETRB的表達(dá)ETRB主要表達(dá)于梗死半球皮層及海馬，見圖3。缺血再灌注組大腦皮層、海馬ETRB的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），見表1。

圖3 各組大鼠梗死半球不同腦區(qū)ETRB的表達(dá)（免疫組化染色 ×200）Figure 3 Expression of ETR-B in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

3 討 論

本課題組前期通過選取5個不同再灌注時間點，模擬缺血性卒中急性和亞急性期的動態(tài)變化過程。結(jié)果顯示ET-1、ETR含量均于再灌注12h處較假手術(shù)組有明顯增高，此與Matsuo等［11］檢測出不同腦區(qū)內(nèi)ET-1在再灌注6h處達(dá)一高峰，且ET-1含量的高表達(dá)持續(xù)了至少48h大致相符。本文揭示了大鼠腦缺血及再灌注中ET-1及ETR的時間與部位表達(dá)特征。因缺血性腦卒中急性期主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激損傷［12-13］，且BQ123（ETRA拮抗劑）可降低腦缺血24 h大鼠腦內(nèi)丙二醛含量、增加谷胱甘肽水平［14］，我們推斷，缺血后首個24 h內(nèi)ETRA以及ET-1水平的增加可能是氧化應(yīng)激所致，增加的ET-1可能聯(lián)合腦內(nèi)其他旁路機(jī)制（諸如AKT/eNOS/ROS）共同造成腦損傷［15-17］。此外，Clazosentan（ETRA拮抗劑）僅改善了再灌注72 h和7 d的腦水腫，對再灌注24 h及更早的腦水腫、血腦屏障破壞無顯著作用［8］，提示我們再灌注24 h至7 d的ET-1、ETRA可能參與缺血后期腦水腫及血腦屏障損傷。

腦缺血后及再灌注中全腦不同區(qū)域ET-1、ETR的表達(dá)定位目前報道較少。本實驗選取再灌注12h為典型時間點，免疫組化結(jié)果得出，假手術(shù)組ET-1、ETR的腦內(nèi)分布與生理狀態(tài)下無異［7，18］，缺血后兩側(cè)腦半球皮層、尾殼核，海馬區(qū)ET-1陽性信號較強(qiáng)，屬缺血半球內(nèi)最強(qiáng)，而以上腦區(qū)恰恰是最不能耐受缺血缺氧的腦組織［19］。先前學(xué)者提出，腦缺血后腦組織存在選擇性損傷現(xiàn)象，那么ET-1、ETR的分布特征是否與選擇性腦損傷相關(guān)？據(jù)研究，缺血后再灌注期易損腦區(qū)GABA能神經(jīng)元內(nèi)高表達(dá)ECE-2［20］，其參與ET-1合成且發(fā)揮作用的最適PH值為5.5（腦缺血環(huán)境）［5］，由此我們推斷，腦缺血后再灌注中腦內(nèi)ET-1含量主要來自局部合成，且在各腦區(qū)內(nèi)呈“選擇性表達(dá)”，其表達(dá)定位的腦區(qū)與腦組織缺血后選擇性損傷的腦區(qū)相關(guān)。

生理狀態(tài)下，正常血管肌源性反應(yīng)、肌張力調(diào)節(jié)對血流量及灌注壓的維持非常重要，該作用很大一部分依賴于腦內(nèi)ETRA、ETRB的協(xié)同作用［21-22］。本實驗中，再灌注12h雙側(cè)半球內(nèi)MCA、軟腦膜動脈及脈絡(luò)叢中ETRA的表達(dá)增多。結(jié)合先前研究：腦梗死后SB234551（ETRA拮抗劑）可明顯提高雙側(cè)半球腦灌注［23］，我們猜想，ETRA不僅參與生理狀態(tài)下腦內(nèi)血管的肌源性反應(yīng)、肌張力調(diào)節(jié)，更有可能是腦缺血后再灌注中引起腦血流降低的有害因素，而其機(jī)制可能是ETRA引起的血管收縮效應(yīng)強(qiáng)于ETRB介導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)，使得腦自動調(diào)節(jié)功能受損。腦缺血后拮抗ETRB能否獲得腦保護(hù)作用備受爭議。本研究中，缺血半球內(nèi)ETRB于皮層及海馬中增生的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。結(jié)合先前學(xué)者研究，增生的ETRB對腦組織既有害又有利［18，24］，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長加速能量衰竭的同時，可促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)產(chǎn)生腦保護(hù)。我們認(rèn)為，當(dāng)缺血性腦損傷發(fā)生時，腦內(nèi)增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞是ETRB的主要來源，過表達(dá)的ETRB兼有損傷及腦保護(hù)作用，此為后期阻斷/激動ETRB的研究提供了一定的理論參考。

本研究存在以下不足：一是未能實現(xiàn)ET-1、ETR于腦內(nèi)的共定位；二是缺乏評價腦缺血后大鼠相關(guān)受損的神經(jīng)功能的動態(tài)監(jiān)測，而這些將是本課題組進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

總之，實驗結(jié)果顯示ET-1，ETR在腦缺血后再灌注中呈“選擇性表達(dá)”。ETRA的過表達(dá)可能是引起腦缺血后腦血流降低的主要原因，ETRB在腦缺血后具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。