王婷婷，韓 影，高芳芳，葉 磊，張育軍

0 引 言

外泌體（exosomes）是由細(xì)胞向細(xì)胞外主動(dòng)分泌的具有典型磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的一種囊泡，其大小介于30～200 nm之間［1-2］。外泌體內(nèi)含有細(xì)胞來源的各種蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)分子，在細(xì)胞-細(xì)胞間物質(zhì)傳遞及信息交流具有重要作用，參與了多種疾病的發(fā)生［3-4］，外泌體亦可作為藥物載體及疾病的治療靶點(diǎn)［5］。

目前所研究的外泌體主要來自于各種體液如血液、尿液、腹腔積液、膽汁等及細(xì)胞上清液中［6］。由于外泌體的獲取及操作較為簡(jiǎn)便，且內(nèi)容物豐富，因此已成為臨床及基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，對(duì)于疾病的診斷和治療具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。外泌體的提取、鑒定已有較多研究報(bào)道［7-8］，經(jīng)典的提取方法有超速離心法、PEG沉淀法及超濾法等。但是其保存方法、保存時(shí)間、保存效果的評(píng)估研究較少［9］，體液保存時(shí)間及溫度對(duì)于其中外泌體的生物學(xué)特性的影響亦鮮少報(bào)道。由于臨床取材具有例數(shù)少、頻次高的特點(diǎn)以及生物樣本庫的廣泛開展，使得樣本保存至超低溫冰箱批量處理成為可能。因此本研究主要圍繞保存在超低溫環(huán)境下的不同時(shí)間血漿及血清樣本中外泌體的生物學(xué)特性進(jìn)行展開。主要觀察不同保存時(shí)間的血漿及血清中外泌體的大小、密度、形態(tài)及陽性蛋白表達(dá)有無改變。

1 材料與方法

1.1 材料本研究使用新鮮采集及1、3、5年前收集后凍存在-80℃冰箱的血漿及血清各3份，均來自于北京大學(xué)人民醫(yī)院生物樣本庫。血漿及血清外泌體提取使用SBI Exoquick試劑盒，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光液來自美國(guó)Thermo Fisher公司。外泌體中蛋白Western blot所用一抗TSG101和CD63抗體均使用Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取血漿及血清外泌體提取使用Exoquick試劑盒，操作方法遵循說明書。具體操作步驟如下：血清血漿4℃，10 000×g離心10 min預(yù)處理，隨后將離心得到的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，按照250 μL血清血漿的體積加63 μL Exoquick試劑的配比加入Exoquick試劑，4℃靜置30 min。離心1500×g，30 min，棄上清，得到的沉淀用 200 μL 1x PBS重懸即為外泌體。

1.2.2 外泌體粒徑分析經(jīng)過Exoquick試劑盒提取得到的外泌體取50 μL加950 μL 1xPBS進(jìn)行1∶20稀釋，使用0.22 μm濾膜過濾外泌體稀釋液。過濾后的外泌體懸液直接使用納米粒度顆粒跟蹤分析儀（NanoSight NS 300）進(jìn)行粒徑檢測(cè)，使用軟件NTA 3.2 Dev Build 3.2.16進(jìn)行分析。NanoSight NS 300配備sCMOS相機(jī)進(jìn)行拍攝，激光類型為Blue488，快門317，增益15。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.2.3 外泌體透射電鏡本研究采用1%醋酸乙酰鈾負(fù)染法對(duì)外泌體進(jìn)行透射電鏡觀察。外泌體電鏡制備方法參考SBI公司提供的‘TEM Serum Procedure with Exoquick’電鏡操作流程。具體操作步驟如下：血漿及血清冰上融化后，取500 μL加100 μL Exoquick試劑，4℃放置2 h以上。隨后3000 r/min離心 20 s，棄上清，加 450 μL 1xTBS緩沖液溶解。取10 μL稀釋10倍后，4%多聚甲醛固定10 min。將不同樣品的外泌體懸浮液（約5 μL）滴至包被聚醋酸甲基乙烯脂的碳化銅網(wǎng)上，室溫放置4～5 min，濾紙吸干殘余液體。滴加負(fù)染液1%水醋酸雙氧鈾（5 μL）于銅網(wǎng)上反應(yīng)1 min，然后用濾紙吸干，清洗2遍。使用透射電鏡JEM1400PLUS（JEOL USA Inc.，Peabody，MA）高壓120 kV及UltraScan 4000電荷耦合攝像機(jī)及First Light Digital Camera Controller（Gatan Inc.，Pleasanton，CA）進(jìn)行拍照。

1.2.4 Western blot法參照文獻(xiàn)［10］，選擇膜結(jié)合蛋白TSG101和跨膜分子CD63作為外泌體的外泌體陽性表達(dá)標(biāo)志物。使用Western blot對(duì)外泌體中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析同樣體積、不同保存時(shí)間的血漿及血清外泌體蛋白的表達(dá)變化情況。血漿及血清中提取后的外泌體取50 μL加等量的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣量70 μg，使用12.5%的分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE膠蛋白電泳，恒壓80 mV，120 min。外泌體標(biāo)志蛋白CD63轉(zhuǎn)膜條件為恒流200 mA，70 min，TSG101轉(zhuǎn)膜條件為200 mA，100 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗孵育過夜。1×TBST洗3遍后，抗兔二抗室溫孵育1 h，1×TBS洗3遍后ECL發(fā)光。

2 結(jié) 果

2.1 不同保存時(shí)間的血漿及血清外泌體數(shù)量及大小保存時(shí)間達(dá)3年的血漿中的外泌體粒徑較大（30～200 nm）。外泌體粒徑大小的峰值整體較?。ǎ?00 nm），考慮原因可能與提取方法有關(guān)。此外，1 mL血清或血漿能提取到的外泌體數(shù)量在1×1010以上，其中血清中外泌體數(shù)量較血漿中數(shù)量略高，見表1。

2.2 不同保存時(shí)間的血漿及血清外泌體形態(tài)通過外泌體透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)不同保存時(shí)間的外泌體形態(tài)無太大變化，均為圓形或類圓形結(jié)構(gòu)，杯托狀結(jié)構(gòu)不典型，見圖1。

表1 不同保存時(shí)間血漿及血清中外泌體的粒徑、數(shù)量分析(xˉ±s)Table 1 Diameters and numbers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time(xˉ±s)

2.3 不同保存時(shí)間的血漿及血清外泌體蛋白表達(dá)情況保存5年的血漿及血清外泌體中TSG101的表達(dá)發(fā)生明顯降低，CD63分子在保存時(shí)間超過1年的血漿及血清外泌體中均發(fā)生明顯降低，且保存時(shí)間越久，其表達(dá)水平越低。此外，對(duì)比血漿及血清外泌體中的蛋白表達(dá)情況可以發(fā)現(xiàn)血清中外泌體蛋白表達(dá)量，見圖2。

圖1 鏡下觀察不同保存時(shí)間的血漿及血清中的外泌體Figure1 Transmission electron microscopic images of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

圖2 不同保存時(shí)間的血漿及血清中外泌體標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expression of the protein biomarkers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

3 討 論

提純好的外泌體保存溫度及保存時(shí)間對(duì)其生物學(xué)特性的影響已有相關(guān)報(bào)道。Park等［9］分別對(duì)比了卡波式肉瘤感染的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中提取的外泌體在37℃、4℃、-20℃及-70℃的不同保存溫度下的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性改變，其發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間（1～25d）的延長(zhǎng)，外泌體的直徑減小，密度亦降低（-70℃除外）。其CD63及CD81的蛋白表達(dá)在37℃環(huán)境下隨時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生減弱，不同保存條件下的外泌體處理正常人類靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)在37℃和-20℃時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)其補(bǔ)體激活功能逐漸降低。另一篇報(bào)道指出，外泌體提取后保存至4℃和-80℃條件下會(huì)導(dǎo)致其直徑變大，且不同保存條件下其外泌體內(nèi)含蛋白可檢測(cè)到的種類及數(shù)量存在較大差異［11］。Kalra等［12］報(bào)道外泌體中TSG101蛋白在超低溫條件下存放90d依然可被檢測(cè)到，然而更長(zhǎng)時(shí)間的研究尚未報(bào)道。我們的研究進(jìn)行了不同保存時(shí)間下血漿及血清中外泌體中蛋白表達(dá)的對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存時(shí)間5年的血漿外泌體中TSG101及CD63表達(dá)明顯降低，此種變化在血清中變化更為明顯，而保存時(shí)間較短的血漿及血清中外泌體蛋白改變不明顯。因此進(jìn)行外泌體中蛋白表達(dá)研究時(shí)血漿或比血清更具優(yōu)勢(shì)。此外，提純后的血漿外泌體保存一定時(shí)間后或不如將血漿保存至超低溫條件待實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備好后進(jìn)行批量提取再進(jìn)行相應(yīng)研究。除了對(duì)比不同保存時(shí)間血漿及血清中蛋白的表達(dá)改變情況，本研究還通過外泌體粒徑分析、電鏡下觀察外泌體形態(tài)改變綜合評(píng)估了不同保存時(shí)間下外泌體物理特征的改變。我們發(fā)現(xiàn)不同保存時(shí)間的外泌體形態(tài)無太大變化，均為圓形或類圓形結(jié)構(gòu)，杯托狀結(jié)構(gòu)不典型，可能與外泌體提取方法及透射電鏡制片方法有關(guān)。但是其大小和形態(tài)均符合外泌體的一般表現(xiàn)，因此說明保存時(shí)間及樣本類型對(duì)外泌體的大小和形態(tài)學(xué)變化無太大影響。

Chen等［13］的研究中表明保存時(shí)間超過5年的血漿中外泌體磷酸化蛋白尚能被檢測(cè)，我們選取TSG101胞質(zhì)蛋白和CD63跨膜蛋白作為外泌體蛋白穩(wěn)定性的指示物，僅具有一定的代表性，未進(jìn)一步進(jìn)行磷酸化蛋白的穩(wěn)定性檢測(cè)，此為本研究的不足之處。外泌體內(nèi)除了含有蛋白質(zhì)亦具有豐富的RNA及DNA等核酸物質(zhì)［14］，不同的外泌體分離方法和RNA提取方法分離及提取出的外泌體中RNA表達(dá)具有一定的差異性［7，15］，然而保存時(shí)間對(duì)于外泌體中RNA表達(dá)的影響目前尚無相關(guān)報(bào)道。由于本研究中血漿及血清的體積較小，未能進(jìn)行RNA的檢測(cè)，亦為本研究不足之處。

外泌體提取方法目前已有較多研究，超速離心法目前仍為最經(jīng)典的方法，然而因其得率低、對(duì)樣本量要求較高及超速離心對(duì)外泌體的損傷影響限制了其廣泛的應(yīng)用［16］。本研究使用基于PEG沉淀原理的Exoquick試劑盒法提取外泌體，充分提升了其得率，降低了初始樣本要求體積并能有效保護(hù)外泌體的形態(tài)完整性。有研究表明不同提取方法對(duì)于外泌體的物理學(xué)特性及生物學(xué)功能無太大影響［7］，另一篇關(guān)于外泌體提取方法的研究表明Exoquick試劑盒法與超速離心法提取的外泌體純度及質(zhì)量均較高［8］。因此，對(duì)于樣本較珍貴且樣本量有限的研究推薦使用試劑盒法進(jìn)行外泌體提取。

綜上，本研究對(duì)比了不同保存時(shí)間的血漿及血清中外泌體的生物學(xué)特性，表明保存時(shí)間對(duì)于外泌體大小及形態(tài)無明顯影響，但是其標(biāo)志性蛋白TSG101、CD63的表達(dá)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)具有明顯降低，尤其在保存時(shí)間超過3年時(shí)，因此進(jìn)行外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)的相關(guān)研究時(shí)推薦新鮮提取立即實(shí)驗(yàn)。外泌體分布于各種體液中，其取樣過程對(duì)于臨床患者具有很大的便捷性及依從性，在基于液體活檢的輔助診斷中具有重要價(jià)值［17］，外泌體亦可作為疾病治療的藥物載體及治療靶點(diǎn)［18］，對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施及發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。在臨床及基礎(chǔ)科學(xué)研究中，常累積大批血清或血漿樣本進(jìn)行相應(yīng)的外泌體檢測(cè)，因此多方面評(píng)估其保存時(shí)間對(duì)于外泌體生物學(xué)特性的影響具有重要的指導(dǎo)意義。

血漿和血清的保存時(shí)間對(duì)其中外泌體的形態(tài)特征無大影響，但是隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，外泌體中的蛋白標(biāo)志物TSG101和CD63含量發(fā)生降低。這提示我們進(jìn)行外泌體蛋白的相關(guān)研究時(shí)最好新鮮提取外泌體立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。