曹 欣,陸婷婷,胡 蘊(yùn),李國慶,程 亮,劉曉梅,毛曉明

0 引 言

Graves′病是常見的器官特異性自身免疫性疾病，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用，但確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素的變化會(huì)引起甲狀腺激素的波動(dòng)，抑郁往往伴隨甲狀腺激素水平下降，而精神緊張或情緒激動(dòng)會(huì)引起甲狀腺激素水平的升高［1-2］。在Graves′病的治療過程中也發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素水平在一定程度上也決定了Graves′病的病理進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸，抗甲狀腺藥物最主要的作用是抑制甲狀腺激素合成，藥物治療后近一半的患者可以痊愈，并且高甲狀腺激素水平與藥物治療后甲亢復(fù)發(fā)密切相關(guān)［3-4］，抗甲狀腺藥物治療過程中出現(xiàn)反復(fù)甲減可以減少停藥后甲亢的復(fù)發(fā)［5］。因此，甲狀腺激素水平的升高可能在Graves′病的發(fā)病、病理進(jìn)展以及轉(zhuǎn)歸中起重要作用。但甲狀腺激素是否會(huì)引起免疫功能的變化目前仍不清楚。體液免疫異常在Graves′病發(fā)病中起重要作用，B淋巴細(xì)胞激活并合成、分泌促甲狀腺激素受體抗體（Thyrotrophin receptor antibody，TRAb）是Graves′病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，本研究通過皮下注射三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）誘導(dǎo)小鼠高T3狀態(tài)，觀察甲狀腺激素對B細(xì)胞活化的影響作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑APC-鼠抗人B220、PE-鼠抗人CD138、PE-Cy7-鼠抗人IgM、PE-鼠抗人IgD、PE-Cy7-鼠抗人IgG（美國BD公司）、大鼠抗BAFF抗體（英國abcam公司）、小鼠臟器淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锕荆?、TRIzol（美國Life公司）、抗大鼠二抗（CST公司）、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（日本Takara公司）、引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）、BCA蛋白提取試劑盒（美國sigma公司），T3（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 儀器分選型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型（美國ABI公司）、酶標(biāo)儀680型（美國BIO-RAD公司）、高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、紫外分光光度計(jì)（德國Eppendorf公司）、化學(xué)發(fā)光檢測儀Modular Analytics E170 analyzer（德國Roche Diagnostics GmbH公司）

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SCXK（蘇）2002-0031，由南京市第一醫(yī)院提供。小鼠置于濕度45%～50%，溫度（22±4）℃左右環(huán)境中飼養(yǎng)，自由采光。將小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（n=30）和T3組（n=50），分別予對照組和T3組小鼠每天皮下注射200 μL等滲鹽水和等量5 μg/10 g T3，以固定量的飼料和飲水喂養(yǎng)小鼠，6周后稱量小鼠剩余飼料和飲水，計(jì)算小鼠的飲食量和飲水量。

1.2 方法

1.2.1 qPCR檢測脾組織細(xì)胞BAFF miRNAs的表達(dá)用Trizol法提取小鼠脾組織RNA，Miscript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄miRNA cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增內(nèi)參和目的基因BAFF，通過2-△△Ct計(jì)算脾組織中BAFF的相對表達(dá)量。（內(nèi)參及目的基因 的 基 因 序 列 ：Mouse β -actin F：5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R：5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′； MouseBAFFF：5′-CCACCGTGCCTCTGTTTTTG-3′，R：5′-CTTCTGCGGAGTGATGGGAT-3′）。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測漿細(xì)胞及B細(xì)胞表達(dá)抗體的比例T3注射6周后取小鼠外周血、骨髓、新鮮脾，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。加入APC標(biāo)記的B220抗體、PE標(biāo)記的CD138、PE-Cy7標(biāo)記的IgM、PE標(biāo)記的IgD抗體，PE標(biāo)記的IgG抗體，流式細(xì)胞儀檢測每份標(biāo)本中B220+CD138+，B220+IgM+IgD+細(xì)胞的比例。

1.2.3 Western blot方法測定BAFF表達(dá)提取脾組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育曝光、顯影，軟件分析比較各組BAFF蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4 HE染色及免疫組化分別取對照組、T3組小鼠喂養(yǎng)6周后甲狀腺和脾標(biāo)本，固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm，常規(guī)HE染色。將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化、封固、加入大鼠抗BAFF單克隆抗體，加二抗、顯色、沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封固，觀察對比兩組小鼠甲狀腺以及脾BAFF表達(dá)。

1.2.5 ELISA法測定血漿BAFF水平分別取對照組、T3組小鼠喂養(yǎng)6周后血漿，按照試劑盒說明書ELISA測定血漿中BAFF水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ± s）表示，2組間計(jì)量資料數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高T3對小鼠飲食、飲水以及體重的影響結(jié)果顯示，注射T3 6周后，T3組小鼠血漿T3水平、飲食、飲水均較對照組明顯升高（P＜0.01）。見表1。

2.2 高T3對小鼠脾的影響PCR法以及Western blot檢測結(jié)果表明，T3組小鼠單個(gè)核細(xì)胞BAFF的相對 mRNA 以及蛋白表達(dá)（2.03±0.52、0.50±0.03）較對照組（1.06±0.19、0.05±0.01）升高（P＜0.01），見圖1。HE染色結(jié)果表明，T3組小鼠較對照組小鼠脾體積明顯增大，白髓區(qū)明顯增大，且出現(xiàn)白髓區(qū)融合。小鼠脾稱重表明，T3組小鼠脾重量［（0.137±0.042）g/只］高于對照組［（0.093±0.03）g/只］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，T3組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞BAFF表達(dá)明顯增加。見圖2。流式細(xì)胞儀檢測顯示，T3組小鼠脾漿細(xì)胞數(shù)量以及B細(xì)胞中表達(dá)抗體比例較對照組增加（P＜0.05），見圖3，表2。

表1 各組小鼠體重、飲食以及飲水量變化Table 1 Changes in body weight,diet,and water intake in each group（xˉ±s）

表1 各組小鼠體重、飲食以及飲水量變化Table 1 Changes in body weight,diet,and water intake in each group（xˉ±s）

與對照組比較，*P＜0.01

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圖1 Western blot檢測小鼠脾BAFF蛋白水平表達(dá)Figure1 Expression of BAFF protein level by western blot

圖2 鏡下觀察高T3對小鼠脾的影響（免疫組化×100）Figure 2 The effects of high T3 on mouse spleen by microscope（IHC ×100）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾漿細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)抗體比例Figure 3 Proportion of spleen plasma cells and B cells antibodiesexpressingineachgroupbyflowcytometry

表2 各組小鼠脾和外周血中漿細(xì)胞比例和B細(xì)胞中表達(dá)抗體比例的比較（xˉ±s，%）Table 2 Proportion of spleen and peripheral blood plasma cells and B cells antibodies expressing in each group（xˉ±s，%）

2.3 高T3對小鼠骨髓以及外周血的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，T3組小鼠骨髓漿細(xì)胞比例以及抗體表達(dá)較對照組明顯增加（P＜0.05），見圖4，外周血漿細(xì)胞比例以及抗體表達(dá)較對照組降低（P＜0.05），見圖5，表2。ELISA檢測結(jié)果表明，T3組小鼠外周血 BAFF水平［（7.61±1.72）pg/mL］較對照組［（5.98±0.78）pg/mL］明顯升高（P＜0.01）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠骨髓漿細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)抗體比例Figure 4 Proportion of bone marrow plasma cells and B cells antibodies expressing in each group by flow cytometry

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血脾漿細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)抗體比例Figure 5 Proportion of peripheral blood plasma cells and B cells antibodies expressing in each group by flow cytometry

2.4 高T3對小鼠甲狀腺的影響HE染色結(jié)果顯示，T3組小鼠甲狀腺出現(xiàn)濾泡上皮細(xì)胞融合，濾泡內(nèi)甲狀腺球蛋白染色變淺，提示甲狀腺球蛋白含量降低。免疫組化結(jié)果顯示，T3組小鼠甲狀腺單個(gè)核細(xì)胞BAFF表達(dá)水平增加，見圖6。

圖6 鏡下觀察高T3對小鼠甲狀腺的影響（HE×100）Figure 6 The effects of high T3 on mouse thyroid by microscope（HE ×100）

3 討 論

許多基因變異或多態(tài)性與Graves′病相關(guān)，如CTLA4、PTPN22、FOXP3、CD25、CD40、Tg 等［6-7］，但遺傳因素在Graves′病中的實(shí)際價(jià)值目前仍停留在疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測，因此探究環(huán)境因素引起Graves′病的機(jī)制在預(yù)防或治療Graves′病更為重要。研究顯示，T3對免疫系統(tǒng)的影響具有多效性，且具有促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟以及免疫應(yīng)答的作用［8］。同時(shí)，T3也可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞由胸腺向外周淋巴器官的歸巢［9］。目前，關(guān)于T3對B細(xì)胞成熟分化機(jī)制的研究相對較少。

TRAb與促甲狀腺激素受體合，持續(xù)性刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞合成及分泌超生理量的甲狀腺激素，從而導(dǎo)致Grave’s病的發(fā)生發(fā)展。TRAb是B細(xì)胞分泌的一種抗體，而B細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，在骨髓中未成熟的B細(xì)胞產(chǎn)生IgM［10-11］，隨著B細(xì)胞的進(jìn)一步成熟，細(xì)胞表面出現(xiàn)IgD，同時(shí)IgM和B220的表達(dá)上調(diào)。在這個(gè)階段，B細(xì)胞離開骨髓進(jìn)入血液循環(huán)和外周淋巴器官，如脾，最終成熟的B細(xì)胞主要合成IgG［12-13］。在外周淋巴器官中，活化的B細(xì)胞進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，并伴隨著幾種膜分子表達(dá)的變化，包括在細(xì)胞表面上調(diào)的B220和初次表達(dá)CD138［14-16］。B細(xì)胞的成熟分化異常被認(rèn)為是觸發(fā)自身免疫連鎖反應(yīng)、引起自身免疫疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵，因此B細(xì)胞有希望成為治療自身免疫性疾病的重要靶點(diǎn)［17］。

BAFF是腫瘤壞死因子家族成員，它在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞及活化的T淋巴細(xì)胞中都有表達(dá)［18］，其他如慢性淋巴細(xì)胞性白血?。˙—CLL）和多發(fā)性骨髓瘤（MM）中的少量B細(xì)胞也可以合成和分泌BAFF［19］，但是在正常人的B細(xì)胞上無BAFF表達(dá)。而BAFF受體主要表達(dá)于B細(xì)胞表面，BAFF與B細(xì)胞表面BAFF受體的結(jié)合過度刺激B細(xì)胞，通過增加B細(xì)胞增殖、減少凋亡以及阻斷自身反應(yīng)性B細(xì)胞的抑制作用，從而促進(jìn)了自身抗體的產(chǎn)生，因此參與B細(xì)胞成熟并分化成漿細(xì)胞的過程［20-22］。有文獻(xiàn)報(bào)道，Graves′病患者血漿BAFF水平明顯高于正常人組和甲狀腺結(jié)節(jié)組，而免疫治療后BAFF水平下降，表明BAFF參與了甲亢的發(fā)生發(fā)展［23-25］。Graves′病患者BAFF與血清TRAb及T3水平呈明顯的正相關(guān)，提示BAFF介導(dǎo)B細(xì)胞激活的過程在Graves′病的發(fā)病中起重要作用［24，26］。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠注射T3后，雖然飲食、飲水明顯增加，但是小鼠總體重量無明顯變化，然而其脾重量和體積明顯增加，表明T3可以減輕小鼠體重，增加脾重量和體積。注射T3后，小鼠骨髓和脾中的漿細(xì)胞和產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞比例明顯增加，而外周血漿細(xì)胞以及產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞比例降低，這表明，T3能導(dǎo)致骨髓以及脾漿細(xì)胞增殖，增加產(chǎn)生自身抗體的數(shù)量并加強(qiáng)外周血漿細(xì)胞向骨髓以及脾的募集。BAFF作為B細(xì)胞的激活因子，注射T3后，小鼠外周血、脾中單個(gè)核細(xì)胞表面的BAFF表達(dá)量明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)T3能夠刺激B細(xì)胞激活。HE染色以及免疫組化結(jié)果顯示，T3組小鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)融合，其單個(gè)核細(xì)胞表面的BAFF表達(dá)增加，表明T3參與激活了甲狀腺內(nèi)B細(xì)胞，并導(dǎo)致甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，T3能促進(jìn)B細(xì)胞在脾和骨髓中的分化。Arpin等［27］的研究表明阻斷T3受體可導(dǎo)致B細(xì)胞增殖分化減少，與本項(xiàng)研究結(jié)果一致。Flavia等［28］研究發(fā)現(xiàn)，T3治療小鼠脾ELISA檢測自身抗體的量明顯增加，與我們研究產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞數(shù)量增加的結(jié)果一致。注射T3后，小鼠脾重量明顯增加，脾白髓區(qū)明顯增大并且脾白髓區(qū)出現(xiàn)明顯的融合，該現(xiàn)象可能與T3造成脾B細(xì)胞多克隆激活有關(guān)［28-29］。本研究首次發(fā)現(xiàn)高T3水平可以導(dǎo)致脾以及外周血單個(gè)核細(xì)胞表面BAFF表達(dá)明顯增加?。文獻(xiàn)報(bào)道，Graves′病患者體內(nèi)BAFF的表達(dá)水平與TRAb和B細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，與我們研究一致，表明BAFF可能參與T3對脾B細(xì)胞的刺激［26］。本研究中，外周血流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，高T3可導(dǎo)致外周血漿細(xì)胞以及表達(dá)自身抗體的B細(xì)胞比例降低。而Flavia等［28］的研究結(jié)果與我們相反，他們發(fā)現(xiàn)T3注射兩周后小鼠外周血漿細(xì)胞比例升高，這可能與我們延長了T3注射周期（延長至6周），從而導(dǎo)致外周血的漿細(xì)胞募集作用有關(guān)，長時(shí)間高水平T3注射后小鼠可出現(xiàn)外周血漿細(xì)胞向其他免疫器官的遷移［30］。Graves′病患者甲狀腺濾泡細(xì)胞數(shù)量增加，這可能與甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)功能損傷的機(jī)制有關(guān)。通過小鼠甲狀腺免疫組化以及HE染色結(jié)果表明，T3可導(dǎo)致小鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞的增加和融合，并且我們發(fā)現(xiàn)甲狀腺濾泡內(nèi)TG減少，這可能表明高T3造成甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)和功能損傷。

目前存在的關(guān)于甲狀腺自身免疫性疾病的治療都各有利弊，因此尋找新的治療方法，更深入的探究疾病的發(fā)生機(jī)制顯得尤為重要［31］。本研究發(fā)現(xiàn)高T3可以激活BAFF，并刺激B細(xì)胞增殖分化，本實(shí)驗(yàn)旨在探究高水平T3對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，雖然小鼠本身并未形成有效的甲亢模型，但是對于未治療甲亢的預(yù)后以及治療后甲狀腺激素居高不下的患者的疾病發(fā)展機(jī)制以及治療方向提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)，對于深入研究Graves′病的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制提供了新的思路。