李雨濛，馬佳康，任凱凱，李 南，王 健，孫金旗，張亞麗，馬 軍

0 引 言

食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于第8位，占所有癌癥死亡率的第6位。中國(guó)食管癌病例占全球一半以上，每年約有15萬(wàn)人死于這一疾病，是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第4大病因。食管癌在組織病理學(xué)和流行病學(xué)上存在較大程度的差異。食管癌主要有食管鱗癌和食管腺癌2個(gè)亞型，我國(guó)食管鱗癌的發(fā)病率達(dá)90%以上，而西方國(guó)家以食管腺癌為主［1］。食管鱗癌主要發(fā)生在食管上段和中段，與吸煙和酗酒關(guān)系密切；食管腺癌主要發(fā)生在和胃相連的食管下部，與肥胖、胃反流和Barrett食管有關(guān)［2］。食管腺癌的男女發(fā)病率亞洲地區(qū)為4∶1，北美地區(qū)達(dá)8∶1；食管鱗癌全球發(fā)病率男女比為2.7∶1，從西亞地區(qū)的1.2∶1到東歐的7.8∶1有較大的變化［3］。但食管鱗癌和食管腺癌在分組特征方面有多大的差異目前并不明確。本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中食管鱗癌、食管腺癌的差異基因，構(gòu)建了相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，篩選出了一批生存相關(guān)的lncRNA、miRNA及mRNA。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)下載及差異基因篩選從TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載食管鱗癌、腺癌的mRNA、lncRNA、miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息。截止2018年10月10日，數(shù)據(jù)庫(kù)中食管鱗癌mRNA及l(fā)ncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)92例，其中81例食管鱗癌組織樣本及11例癌旁正常組織樣本，miRNA食管鱗癌測(cè)序數(shù)據(jù)108例，包括食管鱗癌組織樣本95例，癌旁正常組織樣本13例；食管腺癌mRNA及l(fā)ncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)91例，其中80例食管腺癌組織樣本及11例癌旁正常組織樣本，miRNA食管腺癌測(cè)序數(shù)據(jù)102例，包括食管腺癌組織樣本89例、癌旁正常組織樣本13例。使用R語(yǔ)言“edgeR”包篩選差異基因，篩選條件為：log 2-fold change（logFC）＞2且P＜0.05。

1.2 食管鱗癌和食管腺癌的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出的差異mRNA、lncRNA、差異miRNA在miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行配對(duì)。利用starBase在線軟件（http：//starbase.sysu.edu.cn/）對(duì)篩選出的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，miRDB、miRTarBase、TargetScan3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因，從而得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape v3.5.1軟件進(jìn)行作圖。

1.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及GO、KEGG功能富集分析利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控的靶基因。人類miRNA識(shí)別靶基因的seed區(qū)域比較短，預(yù)測(cè)到的靶基因較多，預(yù)測(cè)結(jié)果在targetscan，miRDB等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。GO、KEGG使用Cytoscape 中的“ClueGO”、“CluePedia”軟件包完成，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4 利用生存分析尋找和生存相關(guān)的差異基因利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中所有食管癌的生存時(shí)間，采用的是R語(yǔ)言中的“Survival”包，對(duì)差異的lncRNA、miRNA、mRNA進(jìn)行生存分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌和腺癌差異基因篩選及ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中食管鱗癌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，共篩選出差異lncRNA1160個(gè)、mRNA 2064個(gè)、miRNA 69個(gè)；腺癌共篩選出差異lncRNA 709個(gè)、mRNA 1490個(gè)、miRNA 81個(gè)。食管鱗癌中，73個(gè)lncRNA、9個(gè)miRNA及13個(gè)mRNA參與構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)；食管腺癌中，51個(gè)lncRNA、10個(gè)miRNA及14個(gè)mRNA參與構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)。食管鱗癌和食管腺癌的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示：PVT1、LINC00524、miR-204、miR-383、HOXC8、NTRK2等在食管鱗癌和腺癌中均起重要調(diào)控作用。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-204靶基因預(yù)測(cè)及GO、KEGG功能分析miR-204-5p經(jīng)miRWalk共預(yù)測(cè)到13227個(gè)調(diào)控靶基因，在targetscan，miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出232個(gè)靶基因。GO功能分析顯示38個(gè)富集，主要參與：細(xì)胞-基質(zhì)黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜投射形態(tài)發(fā)生、β-連環(huán)蛋白結(jié)合等過(guò)程。KEGG分析顯示4個(gè)相關(guān)通路：Hedgehog信號(hào)通路、壽命調(diào)節(jié)通路、雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路。見(jiàn)圖2。

2.3 食管鱗癌和腺癌ceRNA中差異基因生存分析食管鱗癌和腺癌相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異基因生存分析結(jié)果顯示，食管鱗癌中與患者生存相關(guān)的 差 異 lncRNA 包 括 LINC00261、MLIP-IT1、LINC00504，差異miRNA包括hsa-mir-338，未發(fā)現(xiàn)與生存相關(guān)的mRNA。食管腺癌中與生存相關(guān)的差異lncRNA包括CYP1B1-AS1、HOTAIR，差異mRNA包括IL11、NTRK2、ANGPT2、PBK，未發(fā)現(xiàn)與生存相關(guān)的miRNA。

2.4 食管鱗癌和腺癌共有差異基因分析食管鱗癌和腺癌共有的差異lncRNA上調(diào)占15.4%（150個(gè)），下調(diào)占26.8%（158個(gè)）；miRNA上調(diào)占24.2%（22個(gè)），下調(diào)占27.6%（8個(gè)）；mRNA上調(diào)占20.5%（234個(gè)），下調(diào)占23.7%（418個(gè)）。食管鱗癌和腺癌中對(duì)上述共有差異基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示與食管鱗癌和腺癌生存均相關(guān)的lncRNA為AL138789.1；miRNA為hsamir-105-2、hsa-mir-105-1、hsa-mir-767；mRNA 為KIF18A、PBK、GPER1，見(jiàn)圖3。

圖1 食管鱗癌及腺癌相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Competitive endogenous RNA（ceRNA）networks for ESCC（a）and EAC（b）

圖2miR-204靶基因GO及KEGG功能分析Figure 2 GO analysis of the functional enrichments（a）and KEGG analysis of the signaling pathways（b）of the miR-204 target gene

圖3 食管鱗癌和腺癌共有差異表達(dá)基因生存分析圖Figure 3 Venn diagram and Kaplan-Meier survival curves for differentially expressed genes in both ESCC and EAC

3 討 論

EAC和ESCC存在著明顯的流行病學(xué)和組織病理學(xué)差異，預(yù)示著EAC和ESCC可能存在明顯的差異，但ESCC與EAC在分子特征方面的差異目前并不明確。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)ESCC及EAC測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出差異RNA，并成功構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這可能對(duì)研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機(jī)制提供新的方法。

ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了一些在ESCC和EAC均起重要調(diào)控作用的基因。Li PD等研究表明PVT1作為miR-203和LASP1的分子海綿可以促進(jìn)ESCC的進(jìn)展［6］。一項(xiàng)關(guān)于食管癌的研究表明：miR-204可以促進(jìn)Sox4的降解，但這一作用可以被lncRNA UCA1所抑制進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖［7］。miR-204靶基因的GO、KEGG分析也表明其可能參與ESCC及EAC的形成與進(jìn)展。對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異基因進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析篩選出了一批與ESCC及EAC生存相關(guān)的差異基因。其中，LINC00261和miR-338已被證實(shí)參與ESCC的形成與進(jìn)展［8-9］，本研究分析結(jié)果與其相同且發(fā)現(xiàn)它們與患者的預(yù)后相關(guān)。既往研究表明HOTAIR、PBK、NTRK2與ESCC相關(guān)，本研究中發(fā)現(xiàn)它們也可能參與EAC的發(fā)生、發(fā)展并且與患者預(yù)后相關(guān)［10-12］。總之，本研究發(fā)現(xiàn)了一些與ESCC、EAC患者生存相關(guān)的差異基因，可能作為食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)ESCC和EAC在分子特征方面存在差異。為了尋找與ESCC和EAC生存均相關(guān)的差異基因，本研究將分別將ESCC和EAC中的這些差異基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：AL138789.1、hsa-mir-105-2、hsa-mir-105-1、hsa-mir-767、KIF18A、PBK、GPER1與ESCC和EAC患者預(yù)后均相關(guān)，除GPER1在ESCC和EAC中的生存趨勢(shì)一致，其余差異基因在ESCC和EAC中的生存趨勢(shì)則相反。GPER1作為膜性雌激素受體的一種，介導(dǎo)了雌激素靶器官癌癥的發(fā)生發(fā)展，尤其是在乳腺癌中可以與雌激素和表皮生長(zhǎng)因子相互作用使雌激素具有表皮生長(zhǎng)因子的作用［13］，同時(shí)使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥［14］。本研究分析結(jié)果顯示該基因在ESCC和EAC腫瘤組織中表達(dá)均降低，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)，可以作為食管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌中，miR-105-1表達(dá)量降低且與高表達(dá)患者相比生存期明顯縮短［15-16］。ESCC的生存分析與其一致，高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)者更長(zhǎng)；但在EAC患者中的生存趨勢(shì)相反。KIFl8A作為驅(qū)動(dòng)蛋白家族的成員之一，其在維持微管動(dòng)態(tài)和參與細(xì)胞有絲分裂中扮演著重要的角色。研究表明，KIF18A在肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌中表達(dá)增高，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲方面發(fā)揮著重要作用［17-19］，但在胃癌中表達(dá)下調(diào)且與患者不良預(yù)后相關(guān)［20］。本研究分析結(jié)果顯示：KIF18A在ESCC和EAC中均增高，但在高表達(dá)的ESCC患者中預(yù)示著更長(zhǎng)的生存時(shí)間，但在高表達(dá)的EAC中則相反。

總之，本研究分析表明ESCC和EAC可能存在著明顯的分子差異，篩選出的生存相關(guān)差異基因?qū)τ贓SCC和EAC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)作用相反，我們將在今后的實(shí)驗(yàn)中對(duì)具體的作用機(jī)制進(jìn)行探討。