陳瑩 徐俊南 王志翊 翁杰 周小明 王賢川*

代謝組學(xué)是對(duì)生物體體液（如血液、唾液、尿液等）內(nèi)的一切代謝物進(jìn)行定性和定量分析的學(xué)科［1］。代謝組學(xué)利用核磁共振（NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等主要技術(shù)，通過(guò)測(cè)量生物樣品中的小分子物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志以及提示疾病發(fā)病機(jī)制［2-4］。近年來(lái)對(duì)膿毒血癥的研究不斷進(jìn)展，代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科，為膿毒血癥的研究提供了新的思路和方法［5］。由于機(jī)體中毒后代謝組學(xué)改變信息量龐大，用智能的算法挖掘多變量的相互作用至關(guān)重要。當(dāng)前在大數(shù)據(jù)挖掘處理中，有多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，其中支持向量機(jī)（SVM）是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)理論的方法［6］。本文首先通過(guò)GC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)膿毒血癥組、健康對(duì)照組血液成分的變化，形成代謝數(shù)據(jù)集，然后通過(guò)reliefF特征評(píng)估方法篩選出膿毒血癥患者血液中的特異度差異代謝物，再利用機(jī)器學(xué)習(xí)中的SVM分類算法構(gòu)建分類識(shí)別模型，并使用測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)性能評(píng)估，根據(jù)評(píng)估結(jié)果優(yōu)化算法參數(shù)，最后形成最優(yōu)識(shí)別模型。

1 材料與方法

1.1 基于機(jī)器學(xué)習(xí)的膿毒血癥診斷流程 見圖1。

1.2 膿毒血癥樣品收集 收集2014年1月至2015年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科膿毒血癥患者16例。其中男9例，女7例，平均年齡（50.6±7.7）歲。健康組在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心隨機(jī)抽取。其中男8例，女8例，平均年齡（48.1±8.3）歲。該研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。兩組患者在性別、年齡等一般資料上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別從健康對(duì)照組和膿毒血癥組收集血液，然后4℃以4000g離心10min，取上層血清儲(chǔ)存在-80℃直至測(cè)量。1.3 GC-MS數(shù)據(jù)采集 Agilent 6890N-5975B GC/MS，HP-5MS（0.25mm×30m×0.25μm）來(lái)自安捷倫公司（Santa Clara，California，USA）。GC柱溫箱最初設(shè)定在80℃，并保持在該溫度5min。然后以10℃/min的速度逐漸升溫至260℃，然后在260℃保溫10min。電子能量為70eV，EI模式下進(jìn)行檢測(cè)，全掃描模式掃描，范圍為m/z 50-550。GC-MS采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Microsoft Excel中。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集包含了32個(gè)實(shí)例（健康組16個(gè)，膿毒血癥組16個(gè)），其中前177例為檢測(cè)到的峰值，屬性名為檢測(cè)時(shí)間，最后1例為分類屬性，屬性名為class，其中D和M分別代表健康組和膿毒血癥組。

圖1 基于機(jī)器學(xué)習(xí)的膿毒血癥診斷流程

1.4 機(jī)器學(xué)習(xí)環(huán)境 Weka［7］是懷卡托智能分析系統(tǒng)的縮寫，該系統(tǒng)由新西蘭懷卡托大學(xué)開發(fā)。Weka使用Java寫成的，并且限制在GNU通用公共證書的條件下發(fā)布。其可以運(yùn)行于幾乎所有操作平臺(tái)，是一款免費(fèi)、非商業(yè)化的機(jī)器學(xué)習(xí)以及數(shù)據(jù)挖掘軟件。Weka提供了一個(gè)統(tǒng)一界面，可結(jié)合預(yù)處理以及后處理方法，將許多不同的學(xué)習(xí)算法應(yīng)用于任何所給的數(shù)據(jù)集，并評(píng)估由不同的學(xué)習(xí)方案所得出的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)SVM算法采用LIBSVM軟件包［8］實(shí)現(xiàn)，LIBSVM是臺(tái)灣大學(xué)林智仁（Lin Chih-Jen）教授等開發(fā)設(shè)計(jì)的一個(gè)簡(jiǎn)單、易于使用和快速有效的SVM模式識(shí)別與回歸的軟件包。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理 原始數(shù)據(jù)中部分?jǐn)?shù)據(jù)為空，采用0補(bǔ)充。另外，原始數(shù)據(jù)數(shù)值差異較大，需要進(jìn)行歸一化處理。采用weka平臺(tái)規(guī)范化（Nomalize）方法，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，將峰值數(shù)據(jù)歸一化到［0，1］。

2 結(jié)果

2.1 屬性評(píng)估 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有維度大的特點(diǎn)，共計(jì)160個(gè)屬性，為了對(duì)檢測(cè)點(diǎn)以及檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)價(jià)值分析，需要對(duì)這160個(gè)屬性的重要性進(jìn)行評(píng)估，本實(shí)驗(yàn)采用WEKA中的reliefF算法［9］，該算法根據(jù)特征對(duì)近距離樣本的區(qū)分能力來(lái)評(píng)估特征，即相關(guān)特征應(yīng)該使同類的樣本接近，而使異類的樣本之間遠(yuǎn)離。使用該算法評(píng)估得到排名靠前的13個(gè)屬性如表1所示。

表1 屬性評(píng)估結(jié)果

2.2 SVM算法分類實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參數(shù)優(yōu)化分析 WEKA提供了一些參數(shù)優(yōu)化工具可以優(yōu)化基分類器參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中采用CVParameterSelection，該方法采用交叉驗(yàn)證的方法，可以優(yōu)化任意多個(gè)參數(shù)的基分類器。實(shí)驗(yàn)中選擇CVParameterSelection為分類器，LibSVM為CVParameterSelection的基分類器，并設(shè)置CVParameterSelection的交叉驗(yàn)證參數(shù)為G 0.01 0.1 10即設(shè)置參數(shù)G從0.01至0.1迭代（10步），經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得到最佳G參數(shù)值為0.08，分類結(jié)果如下表所示。從表2可以看出，敏感度即真陽(yáng)性率TP =12/（4+12）=75%，特異度即真陰性率TN=11/（11+5）=68.75%，識(shí)別率=（11+12）/（16+16）=71.875%。從表3中可以看出，經(jīng)過(guò)reliefF評(píng)估方法進(jìn)行特征選擇后，敏感度、特異度和識(shí)別率分別提高至75%、100%和87.5%。

表2 預(yù)測(cè)結(jié)果混淆矩陣

表3 reliefF特征選擇對(duì)分類結(jié)果產(chǎn)生的影響（%）

2.3 兩組患者血液主要標(biāo)志物峰面積比較 見表4。

表4 兩組患者血液主要標(biāo)志物峰面積比較（x±s）

3 討論

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)常存在維度高的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬性個(gè)數(shù)達(dá)160個(gè)，采用reliefF評(píng)估方法進(jìn)行特征降維使診斷模型敏感度、特異度和識(shí)別率分別提高至75%、100%和87.5%，另外本研究對(duì)如何尋找分類器最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行了探討，本文提供了一種快速有效的參數(shù)尋找方法，即采用交叉驗(yàn)證參數(shù)選擇法，實(shí)驗(yàn)利用CVParameterSelection方法快速確定SVM最優(yōu)參數(shù)。

本研究中健康組和膿毒血癥組共有13個(gè)生物標(biāo)志物被篩選出，分別是丙三醇、十六酸、十四酸、β-D-呋喃半乳糖苷、丙氨酸、β-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸、十二酸、油酸、d-半乳糖、甘氨酸、d-葡萄糖、d-甘露糖、β-DL-阿拉伯呱喃糖，其中丙三醇、十四酸、β-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸和甘氨酸在兩組間有顯著差異。丙三醇和β-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸在膿毒血癥組患者中顯著升高，而十四酸和甘氨酸在膿毒血癥組患者中顯著下降。這些基于基于代謝組學(xué)結(jié)合reliefF評(píng)估方法篩選出來(lái)的代謝標(biāo)志物有助于對(duì)膿毒血癥患者進(jìn)行診斷及鑒別診斷。

Goossens等［10］研究表明，膿毒血癥大鼠體內(nèi)丙三醇含量降低，可能與膿毒血癥大鼠體內(nèi)促進(jìn)甘油轉(zhuǎn)化為葡萄糖途徑的限速酶活性升高有關(guān)。而本研究中膿毒血癥患者體內(nèi)甘油含量呈增加趨勢(shì)，可能因?yàn)槟摱狙Y患者體內(nèi)脂肪酸分解代謝增加，而脂肪酸分解過(guò)程中將會(huì)產(chǎn)生大量甘油，從而導(dǎo)致膿毒血癥患者體內(nèi)甘油總體呈升高趨勢(shì)。β-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸在本研究中同樣呈升高趨勢(shì)，有望成為膿毒血癥新型代謝標(biāo)志物，但目前尚無(wú)該代謝標(biāo)志物在膿毒血癥方面的研究報(bào)道，其對(duì)膿毒血癥的診斷意義需進(jìn)一步研究。

十四酸又稱肉豆蔻酸，是一種飽和脂肪酸，可以通過(guò)脂肪酸β-氧化途徑進(jìn)行分解代謝。最近關(guān)于膿毒血癥患者體內(nèi)脂肪酸代謝變化的研究不斷增加。Kauppi AM等［11］采用代謝組學(xué)的方法研究膿毒血癥患者體內(nèi)代謝物的變化，共發(fā)現(xiàn)包括十四酸在內(nèi)的6種代謝物顯著變化，其中十四酸是最具預(yù)測(cè)性的代謝物，對(duì)診斷膿毒血癥的敏感度高達(dá)91%，特異度達(dá)70%，準(zhǔn)確性顯著優(yōu)于當(dāng)前的C-反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞等指標(biāo)。甘氨酸又名氨基乙酸，小分子量氨基酸，屬于人體非必需氨基酸，能夠合成DNA，磷脂以及膠原蛋白等。在本研究中膿毒血癥患者甘氨酸含量較正常對(duì)照組顯著下降，提示甘氨酸水平對(duì)膿毒血癥患者具有診斷意義。外源性補(bǔ)充甘氨酸降低膿毒血癥患者病死率，但需要更多臨床研究證實(shí)。

綜上所述，本研究篩選出膿毒血癥患者血液中的四種特異度差異代謝物，為膿毒血癥機(jī)制研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)，所建立的識(shí)別模型，能夠有效預(yù)測(cè)膿毒血癥。