葉國(guó)梅 史亞楠 王蓉蕓 孫秋華 徐小宏*

近年來(lái)，胃腸道吻合口瘺越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視，據(jù)報(bào)道食管和直腸手術(shù)吻合口瘺發(fā)生率約10%～15%，而其他部位消化道發(fā)生率約5%～10%［1］，特別是胃腸道腫瘤術(shù)后常因吻合口瘺而延遲術(shù)后輔助放化療而增加復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［2］。傳統(tǒng)經(jīng)胃腸道給藥或靜脈給藥促進(jìn)吻合口愈合有增加胃腸道負(fù)擔(dān)或增加補(bǔ)液量的弊端。課題組前期研究表明，基于中醫(yī)外治理論參黃膏外敷神闕穴可減輕術(shù)后腸道功能障礙（Postoperative ileus，POI）模型大鼠的小腸平滑肌層炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)胃腸道傳輸。本文進(jìn)一步探討參黃膏外敷兔神闕穴對(duì)胃腸吻合口愈合的影響，為臨床促進(jìn)吻合口愈合提供新的思路和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：24只雄性新西蘭兔，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0003，體質(zhì)量為2.5～3.0kg。（2）參黃膏制備：按課題組前期研究的參黃膏制劑配方（人參、丹參、大黃、枳實(shí)、厚樸、丁香、吳茱萸等藥組成）制備工藝與方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，以質(zhì)量標(biāo)志物的轉(zhuǎn)移率與純度為主要指標(biāo)，確定了參黃方提取純化工藝，以外觀性狀、初黏力、持黏力，質(zhì)量標(biāo)志物的釋放度等為指標(biāo)，進(jìn)行質(zhì)量把關(guān)，由本院制劑室制作用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3］。（3）試劑和儀器：羥脯氨酸試劑盒（R&D公司）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；YAP/TAZ 抗體（Cell signaling公司）；TGF-β1抗體（Santa Cruz公司）；醫(yī)用5-0 VICRYL可吸收線（Ethicon公司）；實(shí)驗(yàn)室連續(xù)傳輸注射泵LSP01-1C（Longer公司）；YB-150A型精密壓力表（溫州正泰儀器儀表有限責(zé)任公司）；Olympus BX53光學(xué)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）造模與給藥：新西蘭兔適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前24h禁食，自由飲水，采用隨機(jī)排列表法將24只兔編號(hào)隨機(jī)均分為對(duì)照組和參黃膏組。兩組均異氟烷吸入麻醉，常規(guī)消毒后取腹部正中切口長(zhǎng)約5cm，打開(kāi)腹腔，距回盲部15cm切除約2cm小腸，5-0 VICRYL可吸收線端端間斷吻合，并關(guān)閉腸系膜，1號(hào)絲線逐層關(guān)閉腹腔。參黃膏組術(shù)后取參黃膏貼，滴數(shù)滴透皮劑至藥膏，均勻浸透后帖敷于兔神闕穴；對(duì)照組使用等量透皮劑滴入細(xì)沙包外敷。術(shù)后自由進(jìn)食飲水；手術(shù)操作均由同一人完成。各組膏貼或細(xì)沙包每天更換2次。（2）觀察指標(biāo)：術(shù)后3d和7d實(shí)驗(yàn)兔再次吸入麻醉下剖腹探查取樣后處死。如吻合口周圍發(fā)現(xiàn)膿苔及壞死組織或明顯漏口者可診斷為吻合口瘺。分別測(cè)定吻合口破裂壓、吻合口羥脯氨酸水平、吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)。①吻合口破裂壓力測(cè)定：參考文獻(xiàn)［4］，分離腹腔粘連，距離吻合口近、遠(yuǎn)端各3cm分別切斷腸袢并置于PBS液中，近端連接YB-150A型壓力計(jì)，另一端接連續(xù)傳輸注射泵，以6ml/min的速率注入亞甲藍(lán)溶液，至吻合口破裂亞甲藍(lán)溢出為止，壓力計(jì)所顯示最高壓力點(diǎn)為吻合口破裂壓值（單位mmHg）。②吻合口組織羥脯氨酸水平測(cè)定：切除約0.5cm寬吻合口組織，4℃PBS洗凈后保存于-80℃冰箱，以高效液相色譜法檢測(cè)羥脯氨酸水平［5］。③吻合口組織膠原纖維含量測(cè)定：吻合口組織甲醛固定后行Masson染色，用VIDHS圖像分析軟件計(jì)算同一視野下膠原纖維總面積與場(chǎng)面積之比表示膠原纖維的面積密度值。④Westblot法測(cè)吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)：術(shù)后7d切除吻合口，4℃PBS液清洗后顯微鏡下清理線結(jié)，冰浴上將組織剪碎，RIPA裂解液裂解勻漿并超聲破碎，4℃ 13000r/min離心15min，取上清液，Bradford法定量測(cè)蛋白濃度，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，65V×2h轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加YAP/TAZ 抗體（1∶1000）和TGF-β1抗體（1∶1000）孵育4℃過(guò)夜，含吐溫PBST液洗脫一抗，加AP標(biāo)記的二抗（兔抗羊，1∶1000）孵育1h，洗脫二抗后滴加顯影液顯色，化學(xué)發(fā)光后壓片，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組吻合口破裂壓力比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組家兔吻合口破裂壓力比較［P/mmHg，（x±s）］

2.2 兩組吻合口羥脯氨酸水平比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組家兔吻合口羥脯氨酸水平比較［Mb/（μmol·g），（x±s）］

2.3 兩組吻合口膠原蛋白比較 見(jiàn)表3。

2.4 兩組吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)比較 術(shù)后第7天westblot法顯示兩組吻合口組織均有YAP、ZAT和TGF-β1蛋白陽(yáng)性條帶。與對(duì)照組比較，參黃膏組吻合口組織YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組術(shù)后7天吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討論

胃腸道術(shù)后并發(fā)吻合口瘺除延長(zhǎng)住院時(shí)間和增加醫(yī)療費(fèi)用外，常繼發(fā)嚴(yán)重水電解質(zhì)紊亂、營(yíng)養(yǎng)不良甚至感染性休克和多臟器功能衰竭，臨床處理非常棘手。據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)直腸癌術(shù)后吻合口瘺圍手術(shù)期病死率高達(dá)6%～22%，且與遠(yuǎn)期腫瘤局部復(fù)發(fā)有相關(guān)性［6］。吻合口愈合過(guò)程受多種因素影響，如吻合口血供、張力、感染、遠(yuǎn)端梗阻以及伴隨疾病等。吻合口瘺的病因處理是關(guān)鍵，但是促進(jìn)吻合口組織愈合也是預(yù)防吻合口瘺的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)抗炎補(bǔ)液及胃腸減壓等手段預(yù)防吻合口瘺效果并不明顯。

研究顯示［7］，采用人參、大黃等藥制成參黃散貼敷治療POI，臨床療效顯著，可促進(jìn)胃癌術(shù)后POI的早期康復(fù)，可能的作用機(jī)制是降低POI兔小腸平滑肌層ICAM-1、IL-6、iNOSmRNA表達(dá)和促進(jìn)IL-10的mRNA表達(dá)，促進(jìn)Ghrelin分泌和增加小腸平滑肌GHS-R1a表達(dá)，而改善POI兔胃腸道傳輸［8-9］。而神闕穴皮膚解剖上無(wú)脂肪組織，角質(zhì)層薄，與腹膜直接相連；臍下腹膜有豐富的靜脈網(wǎng)，藥物在臍滲透后，直接擴(kuò)散至靜脈網(wǎng)而進(jìn)入體循環(huán)。課題組前期研究表明參黃膏經(jīng)神闕穴給藥滲透力強(qiáng)，吸收快，還可避免“首過(guò)效應(yīng)”。臨床實(shí)踐表明經(jīng)外敷神闕穴給藥途經(jīng)優(yōu)勢(shì)獨(dú)特，可避免靜脈輸注和經(jīng)胃腸道用藥，對(duì)于需限制補(bǔ)液量和胃腸道手術(shù)患者尤為有益，而且方法簡(jiǎn)便、患者依從性好、易于推廣應(yīng)用。為此，課題組研制成參黃膏劑型，以新西蘭兔為研究對(duì)象探索參黃膏外敷神闕穴對(duì)胃腸吻合口愈合過(guò)程的影響。吻合口破裂壓可準(zhǔn)確地描述吻合的機(jī)械強(qiáng)度，其主要與吻合處膠原沉積量有關(guān)。羥脯氨酸幾乎只存在于膠原蛋白中，可作為評(píng)估膠原蛋白代謝的有效指標(biāo)［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明參黃膏外敷可提高吻合口破裂壓力，促進(jìn)吻合口膠原沉積和提高羥脯氨酸水平，可顯著促進(jìn)吻合口愈合。

隨后，課題組進(jìn)一步研究參黃膏外敷神闕穴促進(jìn)吻合口愈合可能的機(jī)制。Hippo信號(hào)通路參與調(diào)控組織再生、機(jī)械力傳導(dǎo)和干細(xì)胞更新與分化等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程［11］。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）和轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序（TAZ）為Hippo信號(hào)通路的下游級(jí)聯(lián)效應(yīng)分子。當(dāng)Hippo信號(hào)通路受到抑制時(shí)，YAP/TAZ不被磷酸化而進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，介導(dǎo)TGF-β1通路中Smad-2、p21和Smad-7蛋白的表達(dá)［12］。如YAP/TAZ被磷酸化而裂解，降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）表達(dá)，延緩創(chuàng)口愈合。TGF-β1與成肌纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的分化有關(guān)，介導(dǎo)膠原蛋白的合成和修復(fù)，也與創(chuàng)口收縮有關(guān)。smad-2密切參與傷口愈合過(guò)程，在體內(nèi)傷口愈合過(guò)程中依賴于TGF-β1信號(hào)。膠原蛋白降解一般術(shù)后24h達(dá)到高峰，術(shù)后第7天膠原蛋白合成抑制了膠原蛋白的降解，吻合口愈合反應(yīng)膠原合成與裂解之間平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，術(shù)后7dYAP、ZAT和TGF-β1蛋白在兩組吻合口均有表達(dá)，但與對(duì)照組比較參黃膏組蛋白表達(dá)均明顯增加。說(shuō)明Hippo信號(hào)通路在參黃膏外敷神闕穴可促進(jìn)胃腸吻合口愈合方面發(fā)揮重要作用。