吳同壘，張艷英，陳 娟，于秀劍，黃翠琴，張志強(qiáng)，史秋梅*，朱國強(qiáng)

(1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，福建龍巖364000；4.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009)

沙門菌(Salmonella)是一種食源性致病菌，雞肉、蛋和相關(guān)產(chǎn)品是沙門菌的主要攜帶者，主要通過糞口途徑傳染人和其它哺乳動(dòng)物[1-2]。沙門菌血清型眾多，達(dá)到2600余種，其中腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis)是引起人類和畜禽沙門菌病的主要成員。腸炎沙門菌通過水平傳播和垂直傳播兩種方式傳播，引起雞沙門菌病，也可引起人類的腸胃炎和食物中毒。世界范圍內(nèi)，每年因沙門菌導(dǎo)致的食物中毒造成大約155 000人死亡[3-4]。

腸炎沙門菌為兼性胞內(nèi)寄生菌，能夠在宿主細(xì)胞中存活并增殖。由于生物膜的選擇性通過性，普通藥物難以大量進(jìn)入細(xì)胞，不能徹底殺死病原菌。icdA基因編碼異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)在呼吸鏈的三羧酸循環(huán)中發(fā)揮重要作用，研究顯示其在沙門菌侵入的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)[5]。同時(shí)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌和遲緩愛德華菌的研究發(fā)現(xiàn)IDH能夠顯著激活宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)[6-8]。因此，推測(cè)IDH與沙門菌的抗應(yīng)激能力、胞內(nèi)存活能力和毒力密切相關(guān)[5]。

為了進(jìn)一步證實(shí)IDH在腸炎沙門氏菌中的生物學(xué)功能，本研究利用λ-同源重組技術(shù)對(duì)腸炎沙門菌icdA基因進(jìn)行了缺失，構(gòu)建了該基因的缺失株，并對(duì)該缺失株進(jìn)行體外應(yīng)激試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)和生物被膜檢測(cè)、抗蛋清殺傷試驗(yàn)、胞內(nèi)存活和動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，分析icdA基因的功能，為開發(fā)腸炎沙門菌疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 腸炎沙門菌c50336、質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20和pBBR322，均由揚(yáng)州大學(xué)朱國強(qiáng)教授惠贈(zèng)。鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)單曉楓教授惠贈(zèng)。BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

PCR Mixture、T4連接酶、DNA Marker和限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白Maker購自Fermentas公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；ID32E生化鑒定試紙條購自法國Biomerieux公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)腸炎沙門菌基因組(CP028151.1)序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物。引物P1和P2由兩部分組成，前半部分(下劃線)與icdA基因同源，后半部分與氯霉素抗性基因(cat)同源，P1和P2用于擴(kuò)增cat基因。引物P3、P4用于擴(kuò)增icdA基因，構(gòu)建互補(bǔ)菌株。引物P5、P6與icdA基因同源，但位于P1和P2引物外側(cè)，用于基因缺失菌株的鑒定。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.3icdA基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[9]，以質(zhì)粒pKD4為模板，使用引物P1/P2克隆氯霉素基因片段并回收，溶解于去離子水中；向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的c50336(攜帶pKD46)菌液中加入終濃度為30 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)2 h，冰浴10 min后，使用冰冷的去離子水洗滌3次，加入去離子水重懸制備感受態(tài)細(xì)胞。將氯霉素片段電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)壯后涂布氯霉素平板，培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。取陽性菌42℃熱激去除質(zhì)粒pKD4，經(jīng)Amp復(fù)篩和PCR鑒定獲得一次重組菌株，命名為c50336::cat。將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化入c50336::cat，經(jīng)篩選得到敲除氯霉素片段的菌株，即為二次重組菌株c50336ΔicdA，再次進(jìn)行PCR鑒定。

使用引物P3/P4擴(kuò)增icdA基因，并連接至質(zhì)粒pBR322中，即為pBR322-icdA。將其電轉(zhuǎn)化至菌株c50336ΔicdA中，經(jīng)鑒定，陽性菌株命名為c50336 ΔicdA+icdA，即為回補(bǔ)菌株。

1.4 重組菌生長曲線及生化特性檢測(cè) 取過夜培養(yǎng)的 c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA菌液，按1∶50轉(zhuǎn)接新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)；每隔2 h取不同時(shí)間點(diǎn)菌液，測(cè)定其OD600nm值，繪制3種菌的生長曲線。同時(shí)，利用ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株生化特性分析。

1.5 重組菌的體外應(yīng)激試驗(yàn) 對(duì)菌株c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA進(jìn)行下列應(yīng)激試驗(yàn)：使用生理鹽水調(diào)整各菌株濃度為1×108cfu/mL；將上述菌株分別與pH3.5和pH10.0的滅菌生理鹽水，37℃孵育30 min，檢測(cè)各菌株對(duì)酸、堿的應(yīng)激；同時(shí)將上述菌株分別與去離子水和2.4 mol/L NaCl溶液，37℃孵育1 h，檢測(cè)各菌株對(duì)低、高滲透壓的應(yīng)激；42℃，于生理鹽水中孵育各菌液10min，進(jìn)行熱應(yīng)激試驗(yàn)；測(cè)定上述菌在含10 mmoL/L H2O2的生理鹽水中，37℃孵育10 min的氧化應(yīng)激。各應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 重組菌的耐藥試驗(yàn) 使用多粘菌素B，在96孔板中進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)：采用倍比稀釋法在第一孔中加入100 μL LB培養(yǎng)基(含濃度1 000 μg/mL多粘菌素 B)，2～12孔加入2倍倍比稀釋的多粘菌素 B，取 c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA菌液，LB稀釋各菌液至 1×109cfu/mL，向96孔板中每孔加10 μL菌液，同時(shí)設(shè)置無多粘菌素B對(duì)照組。37℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.7 重組菌的生物被膜形成能力檢測(cè) 取c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA菌液按 1∶100 的比例接入生物膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以150 μL/孔分裝到96孔板中，置于30℃，80 r/min培養(yǎng)；24 h后棄去菌液，蒸餾水洗去游離細(xì)菌，使用2%結(jié)晶紫室溫染色15 min，蒸餾水洗滌；乙醇溶解結(jié)晶紫，測(cè)量OD575nm值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 重組菌的抗蛋清殺傷試驗(yàn) 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA菌 液 離心后用PBS緩沖液洗滌3次，并稀釋至1×104cfu/mL，加入等體積無菌蛋清充分混勻，37℃孵育1 h，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算3種細(xì)菌存活率。

1.9 重組菌胞內(nèi)存活能力的測(cè)定 取生長良好的鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7，以1×105/孔鋪于24孔細(xì)胞板；將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA細(xì)菌計(jì)數(shù)，以MOI 10的劑量感染Raw264.7細(xì)胞，混勻后孵育1 h，更換為含20 μg/mL慶大霉素的DMEM，以殺死細(xì)胞外的細(xì)菌。在感染后1 h、10 h、24 h采用1%Tritoxn-100裂解細(xì)胞后細(xì)菌計(jì)數(shù)，繪制曲線。

1.10 動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn) 取BALB/c小鼠，每組10只，共分為11組；取c50336和c50336ΔicdA菌液，離心后 PBS重懸，并 10倍倍比稀釋為 1.0×108cfu/mL～1.0×104cfu/mL；1～5組經(jīng)腹腔注射0.2 mL不同濃度c50336，6～10組經(jīng)腹腔注射不同濃度c50336ΔicdA；第11組注射PBS，作為對(duì)照組。感染后連續(xù)記錄小鼠死亡數(shù)，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算各菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié)果

2.1icdA基因缺失株和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定以引物P1和P2，模板質(zhì)粒pKD3，擴(kuò)增氯霉素基因(cat)片段，并電轉(zhuǎn)化至c50336(攜帶質(zhì)粒pKD46)中，陽性質(zhì)粒熱激去除質(zhì)粒pKD46，即為一次重組菌株c50336::cat；利用質(zhì)粒pCP20消除氯霉素片段，得到二次重組菌株c50336ΔicdA，PCR鑒定結(jié)果如圖1A，與預(yù)期相符，表明構(gòu)建了icdA基因缺失菌株。利用質(zhì)粒pBBR322，構(gòu)建回補(bǔ)菌株c50336ΔicdA+icdA，icdA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，泳道1的條帶大小與預(yù)期一致(圖1B)。表明回補(bǔ)菌株正確構(gòu)建。

2.2 重組菌生長曲線測(cè)定和生化特性分析 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA菌株，取各時(shí)間點(diǎn)菌液測(cè)定各自O(shè)D600nm值，繪制3種菌株的生長曲線，結(jié)果顯示，測(cè)試各菌株間生長速度無明顯差異(圖2)，表明icdA基因缺失不引起沙門菌的營養(yǎng)缺陷。

利用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA菌株的生化反應(yīng)譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示3株菌之間生化反應(yīng)譜無區(qū)別，表明icdA基因缺失不改變沙門菌的生化特性。

2.3 重組菌的抗體外應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果 體外應(yīng)激試驗(yàn)檢測(cè)菌株c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA對(duì)酸、堿、熱、高滲、低滲和氧化應(yīng)激的抵抗能力，結(jié)果顯示，相對(duì)于野生型菌株c50336，基因缺失株c50336ΔicdA在堿應(yīng)激(pH=10)、低滲(去離子水)應(yīng)激和氧化應(yīng)激(H2O2=2 mmol/L)條件下的存活率明顯降低，但在熱應(yīng)激(42℃)、酸應(yīng)激(pH=3.5)和高滲應(yīng)激(NaCl 2.4 mol/L)，各菌株存活率未出現(xiàn)顯著變化(圖3)。表明IDH參與腸炎沙門菌對(duì)部分應(yīng)激的抵御，是細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境(包括宿主環(huán)境)生存的重要分子。

2.4 重組菌耐藥試驗(yàn)結(jié)果 利用多粘菌素B進(jìn)行菌株 c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA的MIC實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過計(jì)算，結(jié)果顯示菌株c50336的MIC值 為 15.625(1/26×/103) μg/mL，而 c50336ΔicdA的MIC 為 1.954(1/29×/103) μg/mL，回補(bǔ)菌株的 MIC 與野生菌株一致。icdA基因缺失菌株的MIC值降低8倍(23)，其耐藥性降低(表2)。表明IDH參與了腸炎沙門菌的耐藥機(jī)制。

表2 各菌株對(duì)多粘菌素B的MIC試驗(yàn)

2.5 重組菌生物被膜形成能力分析 采用結(jié)晶紫染色法定量分析菌株c50336、c50336ΔicdA和c50336 ΔicdA+icdA的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示，基因缺失菌株c50336ΔicdA生物膜形成量不足野生菌株的50%(圖4)。表明IDH參與腸炎沙門菌的生物被膜形成，進(jìn)一步揭示其影響腸炎沙門菌耐藥性的機(jī)制。

2.6 重組菌抗蛋清殺傷試驗(yàn) 將c50336、c50336ΔicdA和c50336ΔicdA+icdA調(diào)整濃度為1×104cfu/mL后，與無菌蛋清混合孵育1 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算各細(xì)菌的存活率。結(jié)果顯示，相對(duì)于野生菌株c50336，基因缺失菌株c50336ΔicdA在蛋清中的存活率明顯降低，僅約為野生型菌株的一半，而回補(bǔ)菌株c50336ΔicdA+icdA蛋清存活率得到大部分恢復(fù)(圖5)。表明IDH參與腸炎沙門菌對(duì)蛋清殺傷的防御。

2.7 重組菌的胞內(nèi)存活能力測(cè)定結(jié)果 取c50336、c50336ΔicdA和 c50336ΔicdA+icdA菌 液 計(jì) 數(shù) 后以MOI=10的劑量感染鼠源巨噬細(xì)胞系Raw264.7，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，以Lg(cfu/mL)值作圖評(píng)價(jià)細(xì)菌的胞內(nèi)存活能力。結(jié)果顯示，在感染后的10 h和24 h，基因缺失菌株c50336 ΔicdA的Lg(cfu/mL)值比野生菌株c50336約降低了2，即細(xì)胞載菌量降低了約100倍，而回補(bǔ)菌株載菌量得到部分回復(fù)(圖6)。表明IDH能夠影響腸炎沙門菌的胞內(nèi)存活能力。

2.8 動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果 取野生型菌株c50336和基因缺失菌株c50336ΔicdA，進(jìn)行小鼠感染試驗(yàn)，攻毒后連續(xù)記錄小鼠死亡數(shù)量，利用寇氏法計(jì)算各菌株的LD50，結(jié)果顯示，c50336ΔicdA的 Lg(LD50)值增大2左右，即LD50增大了約100倍(圖7)。表明icdA基因缺失后腸炎沙門菌的毒力顯著降低(p＜0.01)。

3 討論

沙門菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，在細(xì)胞內(nèi)形成包裹菌體的內(nèi)噬體(Salmonella-containing vacuol，SCV)，在SCV保護(hù)下進(jìn)行增殖和擴(kuò)散[9-11]。在細(xì)胞內(nèi)，沙門菌需要調(diào)節(jié)自身的基因表達(dá)，以適應(yīng)和抵御宿主的殺傷，icdA基因在腸炎沙門菌感染細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，提示其參與抵御應(yīng)激，進(jìn)而影響細(xì)菌的毒力。本研究利用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了icdA基因缺失菌株，用于分析icdA基因功能。研究結(jié)果顯示，相對(duì)于野生菌株，icdA基因缺失菌株生化特性，部分應(yīng)激條件下(堿應(yīng)激、低滲、氧化應(yīng)激)存活率未發(fā)生變化，但對(duì)堿應(yīng)激、低滲應(yīng)激和氧化應(yīng)激的敏感性明顯增強(qiáng)，對(duì)蛋清抵抗能力和對(duì)抗菌肽類物質(zhì)多粘菌素B的耐藥性顯著降低，同時(shí)其生物被膜的形成能力也明顯降低。進(jìn)一步利用胞內(nèi)存活試驗(yàn)和動(dòng)物感染試驗(yàn)證明，icdA基因缺失菌株的胞內(nèi)存活能力和對(duì)小鼠的毒力顯著降低(LD50增大)。根據(jù)以往研究報(bào)道[5-8,10]推測(cè)IDH參與沙門菌的致病性。

多粘菌素B是一種抗菌肽類藥物，可作為一大類抗生素的代表，其殺菌方式主要是在微生物的細(xì)胞壁上打孔，形成大分子通道，進(jìn)而釋放細(xì)菌內(nèi)容物，最終引起細(xì)菌死亡[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)icdA基因缺失菌株相對(duì)野生菌株，對(duì)多粘菌素的MIC值降低了8倍，表明其影響腸炎沙門菌的耐藥性。生物被膜形成能力是腸炎沙門菌的重要毒力特征，常常與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)。本研究利用結(jié)晶紫染色法證明，相對(duì)于野生型菌株，icdA基因缺失菌株的生物被膜形成能力降低了約50%，該結(jié)果進(jìn)一步解釋了其耐藥性降低的原因。

腸炎沙門菌常污染雞蛋，被人食用后引起食物中毒，威脅人類健康。一般認(rèn)為，蛋清不允許微生物的生存，因?yàn)槠渲泻写罅康臍⒕煞?，但是腸炎沙門菌能在其中生存，這種生存能力是細(xì)菌垂直傳播和引起人類感染的重要原因[14-16]。本研究證明icdA基因編碼產(chǎn)物參與腸炎沙門菌對(duì)蛋清殺傷的防御作用。在蛋清中生存能力的降低，提示icdA基因缺失株具有作為候選疫苗菌株的可能性，應(yīng)用該缺失菌株作為疫苗使用，可以在一定程度上減少腸炎沙門菌垂直傳播的概率，保障動(dòng)物健康和促進(jìn)食品安全。將icdA基因缺失菌株作為疫苗，還需要分析該菌株的毒力。本研究發(fā)現(xiàn)，icdA基因缺失菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力顯著降低，其LD50也顯著升高，表明該菌株毒力明顯降低，有望作為候選疫苗。