胡 濤，何志遠(yuǎn)，張文昌，趙 俊，王明麗*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，安徽合肥230032；2.安徽九川生物科技有限公司，安徽蕪湖241000)

細(xì)胞因子是人與動(dòng)物在抵御外界病原微生物侵入和感染的長期過程中產(chǎn)生的一類免疫因子，在傳染病的防治中起重要作用[1]，其中干擾素(Interferon，IFN)是一種由病毒或其它IFN誘生劑刺激機(jī)體后產(chǎn)生的一種小分子蛋白質(zhì)，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂增殖和免疫調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。自1986年Lefevre等[2]首次克隆出豬IFNα1(PoIFNα1)基因以來，國內(nèi)外學(xué)者對重組PoIFNα1抗豬病毒性感染及對豬病毒性疾病的治療進(jìn)行了一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[3-4]。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，該細(xì)胞因子在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，其不僅能夠活化巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖分化[5]。

本研究采用RT-PCR方法從雞、豬肝臟細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增雞 GM-CSF(ChGM-CSF)和 PoIFNα1基因，通過柔性linker將ChGM-CSF與PoIFNα1基因連接，構(gòu)建了pET-GM-CSF-PoIFNα1/BL21基因工程菌；并對誘導(dǎo)表達(dá)出的重組蛋白(rChGM-CSF-PoIFNα1)進(jìn)行相應(yīng)活性檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 豬睪丸上皮細(xì)胞(ST cells)、水皰性口炎病毒(VSV)、E.coliDH5α菌株、BL21(DE3)菌株和pET-32a載體均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。實(shí)驗(yàn)用雞(雌雄兼用)和豬(斷奶仔豬)購自安徽省合肥市周谷堆農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場，取其肝臟組織保存于本實(shí)驗(yàn)室；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、IPTG、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；IFN-α活性測定國家標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)：07/01，效價(jià)：11 000 IU/支)；羊抗鼠IgG-HRP和鼠抗重組PoIFNα1單克隆抗體(MAb)購自英國Abcam公司；小鼠抗雞GM-CSF多克隆抗體(PAb)購自Bio-Rad公司；四氮唑藍(lán)(MTT)美國Biotrin公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào)：PC0030)購自索萊寶科技有限公司。EtEraserTMSE安全型內(nèi)毒素去除試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中ChGM-CSF(AJ621740/EU939770.1)與 PoIFN-α1(NM_214393.1)兩種目的基因序列，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)兩對引物。擴(kuò)增ChGM-CSF基因引物序列為：5'-GCGGGATCCATGTTAGCGCAGC-3'/5'-ACCACCA CCAGAACCACCACCACCAATGCAATCTTTTTCTTC CG-3'，擴(kuò)增片段大小為 432 bp。PoIFN-α1：5'-GGT GGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCTGTGCCTG C-3'/5'-CCGAAGCTTAGTGCGCGTGTTG-3'，擴(kuò)增片段大小為501 bp。在擴(kuò)增雞GM-CSF的上游和下游引物中分別引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和Linker序列，在PoIFN-α1的上游和下游引物中分別引入互補(bǔ)的Linker序列和HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物由深圳華大基因股份有限公司合成。

1.3 目的基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 分別從雞和豬肝臟組織中提取其基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得ChGM-CSF和PoIFN-α1的目的基因cDNA，并以各自cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)目的基因。PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃1 min、59℃30 s、72℃10 min，共 30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收各自基因片段，克隆至pMD18-T載體，陽性重組質(zhì)粒由深圳華大基因股份有限公司測序鑒定，正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-ChGM-CSF和pMD-PoIFNα1。

利用重疊PCR通過linker連接重組雞ChGMCSF與PoIFNα1，將獲得的融合目的基因ChGMCSF-PoIFNα1克隆至pET-32a表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株，挑取單菌落進(jìn)行該重組質(zhì)粒的PCR、雙酶切及測序鑒定，重組菌命名為 pET-ChGM-CSF-PoIFNα1/BL21。

1.4 重組蛋白 rChGM-CSF-PoIFNα1的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與檢測 將pET-ChGM-CSF-PoIFNα1/BL21基因工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，測其OD600nm值在0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，32℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，收集菌體，PBS重懸菌體沉淀，4℃超聲破碎細(xì)菌沉淀，12 000 r/min離心15 min。分別取沉淀和上清及裂解前菌體經(jīng)SDSPAGE電泳檢測。

將表達(dá)的rChGM-CSF-PoIFNα1粗制品采用鎳離子親和層析柱純化，采用EtEraserTMSE安全型內(nèi)毒素去除試劑盒對純化后的該重組蛋白去除內(nèi)毒素。將純化后的重組蛋白溶液分別以小鼠抗雞GM-CSF PAb(1∶2 000)和小鼠抗重組 PoIFNα1 MAb(1∶2 000)為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP(1∶15 000)為二抗，經(jīng)western blot鑒定純化的重組蛋白與兩種特異性抗體的反應(yīng)性。

1.5 rChGM-CSF-PoIFNα1刺激雞淋巴細(xì)胞增殖活性的檢測 將純化的rChGM-CSF-PoIFNα1溶液采用Lowry法測定蛋白含量，利用RPMI1640培養(yǎng)液將其稀釋成13個(gè)濃度梯度，分別為600 μg/mL、300 μg/mL、 150 μg/mL、 75 μg/mL、 37.5 μg/mL、18.75 μg/mL、9.38 μg/mL、4.69 μg/mL、2.34 μg/mL、1.17 μg/mL、0.58 μg/mL、0.29 μg/mL 和 0.155 μg/mL；備用。無菌采集雞血2 mL，置于無菌15 mL離心管中，加入同體積的PBS稀釋。按照《中華人民共和國藥典》2015版通則3526“重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子生物學(xué)活性測定法”[6]，以雞外周血淋巴細(xì)胞/MTT比色法檢測不同樣品中蛋白含量及外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)值(SI)，分析ChGM-CSF的生物學(xué)活性。

1.6 rChGM-CSF-PoIFNα1抗病毒活性的測定按照《中華人民共和國藥典》2015版通則3523“干擾素生物學(xué)活性測定法”以及本實(shí)驗(yàn)已建立的檢測方法[7-8]，采用ST細(xì)胞/VSV豬干擾素抗病毒活性和比活性測定系統(tǒng)，以細(xì)胞病變抑制法及以不同稀釋度的IFN-α標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，檢測原液中rChGMCSF-PoIFNα1抗病毒活性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增 分別從雞和豬肝臟組織樣品中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，在約400 bp和500 bp處出現(xiàn)特異條帶，大小與預(yù)期相符(圖1A、圖1B)，初步表明，已分別擴(kuò)增獲得了ChGM-CSF和PoIFNα1目的基因。利用重疊延伸PCR技術(shù)連接目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1 000 bp處出現(xiàn)明顯特異性條帶(圖1C)。融合PCR產(chǎn)物測序和NCBI Blast在線軟件比對分析結(jié)果進(jìn)一步表明，ChGM-CSF和PoIFNα1融合基因正確構(gòu)建。

2.2 pET-ChGM-CSF-PoIFNα1重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 重組表達(dá)載體pET-ChGM-CSF-PoIFNα1經(jīng)雙酶切和質(zhì)粒測序鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒 pET-ChGM-CSF-PoIFNα1經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后在約1 000 bp處可見目的條帶，與預(yù)期相符(圖1D)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank中ChGMCSF基因和PoIFNα1基因序列一致，表明包含該兩個(gè)融合基因的重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。

2.3 rChGM-CSF-PoIFNα1的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定將pET-GM-CSF-PoIFNα1/BL21基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，在55 ku左右處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)期相符(圖2)。同時(shí)該結(jié)果顯示，該目的蛋白條帶表達(dá)量約占菌體總蛋白的35%，且主要以可溶性表達(dá)形式存在于細(xì)胞破碎上清中。將該蛋白通過鎳離子親和層析純化后采用SDS-PAGE檢測其純化效果，結(jié)果顯示，該目的蛋白純度約為90%，純化效果較好。

2.4 重組蛋白的反應(yīng)原性鑒定 分別利用小鼠抗ChGM-CSF PAb(1∶2 000)和小鼠抗重組 PoIFNα1 MAb(1∶2 000)為一抗，對收集的純化后重組蛋白進(jìn)行western blot鑒定。結(jié)果顯示，該重組蛋白可被兩種特異性抗體分別識(shí)別(圖3)。表明該融合蛋白具有與ChGM-CSF和PoIFNα1特異性抗體的雙重反應(yīng)原性。

2.5 rChGM-CSF-PoIFNα1對雞淋巴細(xì)胞增殖活性的檢測結(jié)果 以RPMI 1640培養(yǎng)基作為稀釋液，將純化后去除內(nèi)毒素檢測合格的rChGM-CSF-PoIFNα1(1.2 mg/mL)稀釋為13個(gè)不同濃度的樣本，采用MTT法檢測rChGM-CSF-PoIFNα1刺激雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖效果(酶標(biāo)儀測量OD570nm值)。結(jié)果顯示，當(dāng) rChGM-CSF-PoIFNα1 濃度為 150 μg/mL時(shí)，雞外周血淋巴細(xì)胞的SI值達(dá)到最大值為3.2(圖4)。表明該重組融合蛋白具有明顯促雞淋巴細(xì)胞增殖的活性。

2.6 rChGM-CSF-PoIFNα1抗病毒活性檢測結(jié)果采用細(xì)胞病變抑制法測定純化后的rChGM-CSFPoIFNα1抗病毒活性。其中rChGM-GSF-PoIFNα1純化后原液先稀釋成0.1 μg/mL后開始依次做2倍倍比稀釋，共做10個(gè)稀釋度，同時(shí)設(shè)立上下復(fù)孔；而非融合rPoIFNα1對照蛋白先稀釋成10 ng/mL，再2倍倍比稀釋，設(shè)立上下復(fù)孔，共做10個(gè)稀釋度。結(jié)果顯示，rChGM-CSF-PoIFNα1原液比活性達(dá)到1.1×106IU/mg，比非融合 rPoIFNα1對照蛋白的效價(jià)(3.7×107IU/mL)低 97%(圖 5)。表明 rChGM-CSFPoIFNα1可以明顯抑制VSV引起ST細(xì)胞病變的效應(yīng)。

3 討論

近年來，由于動(dòng)物傳染病致病病原種類多、變異快，一旦發(fā)病，往往呈現(xiàn)傳播性強(qiáng)、危害性大及具人畜共患性特征等特點(diǎn)；而有些傳統(tǒng)疫苗免疫效果較差，又缺少特異性治療藥物，這給動(dòng)物傳染病的預(yù)防、控制和治療造成了極大困難。細(xì)胞因子雖已被廣泛地應(yīng)用在動(dòng)物傳染病的臨床預(yù)防和治療中并取得了一定成績，但因其品種繁多，效力較短暫需要反復(fù)用藥，并有相對種屬特異性等的限制，在臨床實(shí)際應(yīng)用中缺乏實(shí)用性。再者產(chǎn)品自身缺少統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)控手段等，使得細(xì)胞因子在動(dòng)物傳染病預(yù)防和治療方面的應(yīng)用存在許多障礙。因此，研發(fā)動(dòng)物抗感染及預(yù)防用生物制品時(shí)，應(yīng)考慮長效性、多功能性和無種屬特異性的通用型制劑是臨床獸醫(yī)期待的產(chǎn)品。

本研究將雞和豬編碼不同的細(xì)胞因子基因連接出具有不同種屬蛋白質(zhì)的rChGM-CSF-PoIFNα1，并在大腸埃希工程菌中高效表達(dá)了該種新的可溶性重組蛋白。該蛋白分子量(約為55 ku)較大，同時(shí)具有較強(qiáng)的體外抗病毒活性和促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞增殖的活性。Western blot結(jié)果顯示，該融合蛋白具有與ChGM-CSF多抗和rPoIFN MAb的雙重反應(yīng)原性。采用ST細(xì)胞/VSV病毒豬干擾素抗病毒活性和比活性測定系統(tǒng)檢測rChGM-CSF-PoIFNα1的效價(jià)，以不同稀釋度IFN-α標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。所測數(shù)據(jù)分析可知，兩者均具有明顯抗病毒的效應(yīng)，該試驗(yàn)測得rChGM-CSF-PoIFNα1的抗病毒效價(jià)為1.4×106IU/mL，比活性為1.1×106IU/mg。提示 rChGM-CSF不干擾rPoIFNα1的抗病毒效應(yīng)。但與 rPoIFNα1相比，rChGM-CSF-PoIFNα1的比活性降低了97%左右。造成比活性降低的原因一方面可能由于連接的rChGM-CSF相對分子質(zhì)量高達(dá)32 ku，是rPoIFNα1相對分子質(zhì)量的1倍左右；另一方面由于連接rChGM-CSF分子后，rPoIFNα1分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使之與PoIFNα1受體的結(jié)合產(chǎn)生了空間位阻[9]。近年研究顯示，GM-CSF作為疫苗佐劑已在臨床廣泛使用，有效地增強(qiáng)了疫苗的免疫效力[10]。本研究采用MTT法對rChGM-CSF-PoIFNα1促雞淋巴細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果顯示，當(dāng)rChGM-CSF-PoIFNα1蛋白濃度為150 μg/mL時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞的SI值達(dá)到最大值為3.2；表明該重組融合蛋白具有促雞淋巴細(xì)胞增殖的活性，提示該融合蛋白可能具有一定的免疫增強(qiáng)效力。因此，下一步要解決的另一問題是將該融合蛋白作為雞或豬用疫苗佐劑進(jìn)行研究，為探索細(xì)胞因子增強(qiáng)疫苗免疫效力及其相關(guān)的機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。