朱映，沈婧，賀英豪，梁永嬋，路藝，溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

由松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus引起的松材線蟲病對松樹具有毀滅性的危害，在我國主要危害的樹種包括馬尾松Pinusmassoniana、赤松Pinusdensiflora、黑松Pinusthunbergii等[1-2]。通過調(diào)控病原松材線蟲、傳播媒介松墨天牛和寄主松樹以及三者間的關(guān)系，以預(yù)防為主，結(jié)合物理、化學(xué)，和生物防治進(jìn)行綜合治理，但均未能真正防止松材線蟲病的傳播[3-5]。

目前國內(nèi)外對松材線蟲的生物防治主要是利用植物性殺線蟲活性物質(zhì)和生防微生物來實(shí)現(xiàn)[6-8]。Esteyavermicola是第一個(gè)被報(bào)道的松材線蟲內(nèi)寄生真菌，屬于子囊菌門Ascomycota子囊菌綱Ascomycetes肉座菌目Hypocreales的Ophiostomataceae科埃斯特氏屬Esteya的唯一種。E.vermicola是松材線蟲內(nèi)寄生真菌，在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出高侵染率，是一種生物防控松材線蟲病的潛在應(yīng)用對象。迄今在全球范圍內(nèi)已報(bào)道的E.vermicola有6個(gè)菌株。本試驗(yàn)中所用菌株CBS115803，是2000年在捷克斯洛伐克櫟屬植物害蟲正毛束小蠹Scolytusintricatus表面真菌群中發(fā)現(xiàn)的，該菌株與E.vermicola其他菌株相比，對松材線蟲的侵染效果更佳，有著較高的粘附率和致死率，并且不會(huì)影響寄主松樹的生長發(fā)育[9-13]。為探索E.vermicola真菌的最適生長溫度以及不同溫度對真菌E.vermicola感染松材線蟲的影響，筆者針對內(nèi)寄生真菌E.vermicola對松材線蟲的粘附侵染作用進(jìn)行試驗(yàn)，以期尋找控制松材線蟲更加直接的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 真菌菌株E.vermicolaCBS115803和灰葡萄孢菌Botrytiscinerea，由韓國忠南大學(xué)成昌根教授惠贈(zèng)，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室4 ℃條件下斜面保存。供試松材線蟲由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院王新榮老師實(shí)驗(yàn)室提供，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用灰葡萄孢菌繁殖以供利用。

PDA培養(yǎng)基，PDB培養(yǎng)基，WA培養(yǎng)基參照Liou 等人的配置方法[ 9，14]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1E.vermicola孢子懸浮液的制備 在無菌條件下，取E.vermicola菌落生長旺盛的平板邊緣，用打孔器取直徑5 mm菌塊，接種到PDA平板中間，用封口膜封好，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。其次將PDA培養(yǎng)活化過的真菌轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)。6 d后用抽濾裝置過濾得到純的孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板確定孢子濃度，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 松材線蟲懸浮液的制備 將灰葡萄孢菌接種至PDA平板上，26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至菌絲長滿平板，接入松材線蟲后繼續(xù)培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失。使用時(shí)將培養(yǎng)基挑出，用濾紙包住，放入貝爾曼漏斗中，將無菌水倒至淹沒培養(yǎng)基，靜置，配置成一定濃度的線蟲懸浮液。

1.2.3 溫度對E.vermicola生長的影響 無菌條件下，使用打孔器從菌落生長旺盛的平板邊緣取5 mm大小相同的圓形菌塊，放置于PDA培養(yǎng)基中心，并用封口膜封好。設(shè)置15，20，25，30，35 ℃5個(gè)處理溫度，每處理3個(gè)重復(fù)，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)第0，1，3，5，7，9，11天測量E.vermicola生長量，以菌落直徑大小作為衡量生長量的指標(biāo)。

1.2.4 溫度對E.vermicola真菌孢子萌發(fā)的影響 無菌條件下，取1 mL初始分生孢子濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液均勻涂布于WA平板上，并用封口膜封好。設(shè)置15，25，35 ℃3個(gè)處理溫度，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)12，24，48，72，96 h后，分別檢測不同溫度下E.vermicola孢子的萌發(fā)率和1～8 d 后產(chǎn)生的彎孢數(shù)量。

1.2.5 不同溫度下E.vermicola真菌感染松材線蟲能力測定 無菌條件下，取1 mL初始分生孢子濃度為1×106個(gè)/mL的E.vermicola真菌孢子懸浮液均勻涂布于WA平板。置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d后接入1 000頭松材線蟲，然后分別放置于15，25，35 ℃感染。分別于感染后的6，12，24 h計(jì)算松材線蟲的粘附率和死亡率。

粘附率(%)=粘附松材線蟲數(shù)/松材線蟲總數(shù)×100

死亡率(%)=粘附松材線蟲死亡數(shù)/松材線蟲總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差數(shù)法(LSD，P=0.05)進(jìn)行處理間顯著性檢驗(yàn)，并用Microsoft Excel 2007軟件作圖。圖中數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對E.vermicola真菌生長的影響 不同溫度對E.vermicola真菌菌落生長有顯著影響(P<0.05)。25 ℃下真菌生長最快，20 ℃下真菌生長次之，35 ℃下真菌生長最慢。不同溫度處理下的E.vermicola真菌生長速率開始差別不大，從第5天開始，20 ℃和25 ℃開始迅速增長(表1)。

表1 5種溫度下培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola菌株CBS115803平板菌落直徑 mm

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

不同溫度對E.vermicola真菌菌株CBS115803的月型孢子萌發(fā)具有顯著影響(P<0.05)。25 ℃下，真菌孢子萌發(fā)率最快，培養(yǎng)48 h后，月型孢子萌發(fā)率達(dá)到100%；其次為15 ℃，培養(yǎng)96 h后，孢子萌發(fā)率達(dá)到100%(表2)。35 ℃處理組的孢子，第8天萌發(fā)率才達(dá)到100%。

表2 3種溫度下平板培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola菌株CBS115803孢子萌發(fā)率 %

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 溫度對E.vermicola感染松材線蟲能力的影響 培養(yǎng)48 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，粘附率不斷上升。15 ℃處理中孢子對松材線蟲的粘附率最高，達(dá)到60.67%，侵染活力顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05)，25 ℃和35 ℃處理中線蟲也能被孢子粘附，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，被孢子粘附的線蟲并未出現(xiàn)明顯增加，6 h后粘附率保持相對穩(wěn)定(表3)。

35 ℃下菌株對松材線蟲的致死率顯著低于其他溫度，另外兩個(gè)溫度中菌株在致死率上差異不顯著(P>0.05)。在培養(yǎng)12 h內(nèi)，3種溫度下有被菌株孢子粘附的松材線蟲均開始死亡，但死亡率均低于10%，且變化不明顯。在培養(yǎng)48 h后，松材線蟲死亡率15 ℃下最高，為41.67%，其次為25 ℃，為36.54%。在35 ℃下菌株對松材線蟲的侵染活力顯著低于其他溫度，只有5.67%(表3)。

表3 3種溫度下培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola孢子對松材線蟲的粘附率和致死率 %

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

采用不同溫度條件培養(yǎng)菌株，分析菌落直徑、萌發(fā)率等，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下真菌生長狀況有不同程度的差異。Wang等研究表明將E.vermicola置于26 ℃條件下培養(yǎng)，所有E.vermicola均萌發(fā)并且產(chǎn)生月型孢子[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在15 ℃和25 ℃培養(yǎng)條件下，E.vermicola均能萌發(fā)并產(chǎn)生具有粘附線蟲功能的月型孢子，與前人研究結(jié)果相符；而在35 ℃培養(yǎng)條件下，雖然孢子最終能在第8天達(dá)到100%萌發(fā)，但并未產(chǎn)生月型孢子，最后導(dǎo)致其喪失了感染松材線蟲的能力。從試驗(yàn)結(jié)果推測，春秋兩季更適合孢子的生長，若溫度過低會(huì)抑制真菌生長，而長時(shí)間的高溫則會(huì)使孢子失去活性停止生長。所以在中國松材線蟲病危害嚴(yán)重地區(qū)，進(jìn)行有效的生物防治時(shí)應(yīng)該考慮不同季節(jié)對真菌孢子的影響。

本實(shí)驗(yàn)表明在不同溫度下，E.vermicola孢子對松材線蟲均具有侵染活力，首次發(fā)現(xiàn)溫度與真菌侵染活力呈負(fù)相關(guān)，即孢子對松材線蟲的侵染力隨著侵染溫度的降低而增加，在低溫條件下侵染能力明顯強(qiáng)于高溫。在以往的研究中，室溫條件下孢子粘著松材線蟲48 h后，菌絲擠破線蟲體壁向外長出，3～4 d 后菌絲開始生長、分枝蔓延，6 d后長出的菌絲開始產(chǎn)孢進(jìn)行二次生長，在室溫下8～10 dE.vermicola完全消解線蟲[9,16-18]。本實(shí)驗(yàn)中15 ℃條件下孢子侵染線蟲12 h后，已有菌絲擠破線蟲體壁向外長出，部分線蟲已被侵染致死。一方面，溫度條件的差異可能直接影響真菌產(chǎn)生的分生孢子的種類不一，導(dǎo)致侵染活力的表現(xiàn)不同；另一方面，溫度也可能間接影響松材線蟲的活性，進(jìn)而引起侵染活性的差異。

真菌E.vermicola孢子中的月型孢子具有生物防治作用。因此，從理論上來說，獲取大量具有高致病性的月型孢子是利用該真菌防治松材線蟲的基本前提，可將侵染活力最高時(shí)的溫度考慮在內(nèi)，進(jìn)行綜合性分析。而在真菌侵染過程中，15 ℃下對松材線蟲的致病力相對更高，可能是低溫對線蟲的行為能力造成了一定影響，導(dǎo)致線蟲更容易被孢子粘附，具體原因有待進(jìn)一步研究。