胡永亮，白學(xué)慧，陳玉芹，李守嶺，王應(yīng)清

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 瑞麗 678600 )

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale為蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材中珍稀名貴品種之一。因其藥用價(jià)值極高，自然繁殖率低，市場(chǎng)需求量大，以及前期過(guò)度采挖等因素，野生鐵皮石斛已成為瀕危物種。目前，人工規(guī)?；N植是提供鐵皮石斛市場(chǎng)供給的主要途徑。云南作為鐵皮石斛的主要分布區(qū)和適生區(qū)，在瑞麗、芒市、盈江、龍陵、騰沖等21個(gè)縣市均有人工種植。2015年筆者在瑞麗市調(diào)查鐵皮石斛病害，發(fā)現(xiàn)一種鐵皮石斛葉斑病。該病害給種植農(nóng)戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也阻礙了當(dāng)?shù)厥a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。筆者采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS測(cè)序鑒定相結(jié)合方法，主要對(duì)云南瑞麗市鐵皮石斛種植區(qū)的石斛葉斑病病原進(jìn)行鑒定，并初步觀察研究該病原的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 鐵皮石斛病株采集、病害調(diào)查和接種試驗(yàn)均在云南省瑞麗市勐卯鎮(zhèn)鐵皮石斛種植基地進(jìn)行。

1.2 病原菌分離純化 將鐵皮石斛葉片病健交界處組織剪成約0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，依次經(jīng)75%乙醇和0.1%升汞消毒，再用無(wú)菌水洗滌3次后，置于PDA培養(yǎng)基中28 ℃避光培養(yǎng)120 h后，純化菌落并進(jìn)行單孢分離獲得菌絲分離物。

1.3 分離物致病性測(cè)定

1.3.1 離體接種 使用針刺接種法，將純化的菌絲分離物接種到健康的鐵皮石斛葉片上，在28 ℃的人工培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)；對(duì)照組為無(wú)菌水處理，每處理20葉片。定期觀察石斛葉片發(fā)病情況，再對(duì)接種發(fā)病的石斛葉片進(jìn)行病原菌分離。

1.3.2 田間接種 采用苗床噴霧接種，試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，1個(gè)對(duì)照，每個(gè)重復(fù)面積為2 m2，共140株；將病原分離物配制成孢子懸浮液(105個(gè)/mL)，噴灑在田間健康生長(zhǎng)的鐵皮石斛葉片上，保濕24 h以上。對(duì)照組為無(wú)菌水處理，處理10株。定期觀察發(fā)病情況并再次分離病株病原。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征，采用Olympus CX-31顯微鏡對(duì)病原菌的分生孢子、附著胞形態(tài)和大小進(jìn)行觀察和測(cè)量，每個(gè)特征測(cè)量50個(gè)數(shù)據(jù)；采用易創(chuàng)YM130數(shù)字?jǐn)z像機(jī)進(jìn)行顯微照片的拍攝。參照魏景超 等編寫(xiě)的《真菌鑒定手冊(cè)》及陸家云編寫(xiě)的《植物病原真菌學(xué)》[1-2]鑒定病原菌。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 提取rDNA采用CTAB法。隨機(jī)從形態(tài)學(xué)特征相同的4份菌株中選擇1株編號(hào)為SH-2的菌株，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的真菌ITS5′-3和ITS4(5′-3′)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3-4]。

ITS1(5′-3′)：TCCGTAGGTGAACCTGCGC

ITS4(5′-3′)：TCCTCCGCTTATTGATATGC

反應(yīng)體系50 μL包含：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP (2.5 mM) 1 μL，Primer (10 μM) 各2 μL，Genomic DNA 100 ng，Ex Taq (5U/μL) 0.5 μL(Takara，RR001B)；ddH2O補(bǔ)至50 μL。

反應(yīng)條件包含：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[5]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(DNAMAN)。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將直徑為7 mm的菌塊接種到PDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)置分別為5，10，15，20，25，28，30，35 ℃ 等8個(gè)梯度處理)，培養(yǎng)至第5天時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，第10天時(shí)在每個(gè)PDA平板中加入20 mL滅菌水后刮下分生孢子，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定產(chǎn)孢量。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.5.2 pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)飽的影響 將直徑為7 mm的菌塊分別接種到不同pH值(pH=3，4，5，6，7，8，9，10，11)的PDA平板上(用1 M的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))，28 ℃培養(yǎng)至第5天時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，第10天時(shí)血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定產(chǎn)孢量。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.5.3 不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 采用真菌生理培養(yǎng)基(氮源1 g、碳源5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)。以硝酸鉀為氮源，將直徑7 mm的菌絲分別接種在分別含葡萄糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇、麥芽糖和甘油等作為不同碳源的培養(yǎng)基中，分別測(cè)定8種碳源時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，以無(wú)碳源培養(yǎng)基為對(duì)照。以葡萄糖為碳源，將直徑7 mm的菌絲分別接種到含酵母膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀和硝酸鈉等不同氮源的培養(yǎng)基中，分別測(cè)定7種氮源對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，以無(wú)氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)溫度均為28 ℃，到第5天時(shí)測(cè)量菌落直徑并觀察菌落生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用DPS6.55軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀 該病主要危害石斛葉片。葉片感病初期出現(xiàn)深褐色圓形小點(diǎn)，后逐漸變大形成深褐色近圓形或不規(guī)則形凹陷病斑，病斑邊界清晰，后期病斑上散生許多黑色小點(diǎn)。濕度增大時(shí)，病斑上出現(xiàn)橙紅色黏性物。病斑密集的葉片褪綠，之后脫落(圖1A)。該病全年發(fā)生，以5—7月甚為流行。

2.2 病原菌的分離和致病性測(cè)定 對(duì)7個(gè)鐵皮石斛葉片病害樣進(jìn)行病原分離，分離純化后得到4株形態(tài)學(xué)特征一致的菌株。經(jīng)針刺法接種到離體葉片上后，發(fā)病率可達(dá)100%。接種第7天葉片開(kāi)始表現(xiàn)癥狀，在接種部位形成黑色近圓形病斑。田間接種10 d后，3個(gè)重復(fù)的發(fā)病株依次為114株、121株、119株；發(fā)病率均在80%以上。其癥狀與自然發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致(圖1B)，且分離接種致病植株能再次分離出與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。對(duì)照組無(wú)表現(xiàn)癥狀。

圖1 鐵皮石斛炭疽病田間發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，該病原菌菌落呈圓形，菌絲排列整齊，毛絨狀(圖2A)，菌絲初為白色，后漸變?yōu)榛野咨蛏罨疑?。培養(yǎng)7 d后，靠近菌落中央產(chǎn)生輪狀排列的分生孢子盤(pán)，并產(chǎn)生紅色分生孢子團(tuán)(圖2B)。附著孢卵圓形深褐色，(5.6～11.8)μm×(4.1～6.7)μm(圖2C)。分生孢子為圓柱近橢圓形，無(wú)色，單胞，兩端鈍圓，(11.2～15.7)μm×(4.1～6.1)μm(圖2D)。鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloesporioides(Penz.)。

圖2 病原菌菌落/附著胞和分生孢子的形態(tài)特征

2.4 分子生物學(xué)鑒定 病原菌的rDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得551bp的DNA序列(GenBank登入號(hào)為KP229358.1)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，菌株與登入號(hào)為JN687987.1(Colletotrichumgloeosporioides)的菌株相似性最高，達(dá)99%。進(jìn)一步構(gòu)建炭疽菌不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果顯示SH-2菌株與引起苦瓜炭疽病的C.gloeosporioides菌株(登入號(hào)為JN687987.1)遺傳距離最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分支(圖3)。

ITS序列分析證實(shí)菌株SH-2為Colletotrichumgloeosporioides，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為引起鐵皮石斛炭疽病的病原菌為半知菌亞門(mén)腔孢綱黑盤(pán)孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

注：分支點(diǎn)上的數(shù)字代表基于1000次重復(fù)的Bootstrap自舉值圖3 炭疽菌不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 鐵皮石斛炭疽病病原菌菌絲在不同溫度條件下培養(yǎng)5 d，菌絲生長(zhǎng)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(圖4)。在5 ℃時(shí)，病原菌菌絲直徑仍為接種時(shí)大??；在10 ℃時(shí)，病原菌菌絲開(kāi)始向外蔓延，擴(kuò)展直徑可達(dá)10 mm；在15～28 ℃時(shí)，菌絲直徑隨溫度升高逐漸變大；至28 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大，擴(kuò)展直徑可達(dá)52 mm；在28～35 ℃，菌絲生長(zhǎng)隨溫度升高而急劇下降，35 ℃下菌絲生長(zhǎng)已非常緩慢，菌絲未見(jiàn)明顯擴(kuò)展。說(shuō)明該致病菌在低于5 ℃或高于35 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)均受溫度條件限制；菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍為10～35 ℃，最適生長(zhǎng)溫度范圍為15～30 ℃。該病原菌產(chǎn)孢溫度范圍為15～35 ℃，其中最適產(chǎn)孢溫度為25～30 ℃。在15～30 ℃時(shí)，其產(chǎn)孢量隨溫度升高而增加，到達(dá)其最適產(chǎn)孢溫度30 ℃時(shí)產(chǎn)孢量可達(dá)26×106個(gè)。從30 ℃上升到35 ℃時(shí)，產(chǎn)孢數(shù)量迅速下降，溫度對(duì)其產(chǎn)孢能力破壞明顯(圖4)。

注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差圖4 不同溫度對(duì)鐵皮石斛炭疽菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.2 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 鐵皮石斛炭疽病病原菌在pH值為3～11的PDA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但生長(zhǎng)狀態(tài)不盡相同，酸性條件更適宜其產(chǎn)孢，尤其是pH值為3～4時(shí)其產(chǎn)孢量最大；而菌絲最適生長(zhǎng)pH值為5～6(圖5)。

圖5 不同pH培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛炭疽菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.5.3 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 膠孢炭疽菌對(duì)各種碳源均有較好的利用能力，菌絲生長(zhǎng)良好，菌落直徑顯著高于對(duì)照(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明此菌對(duì)碳源要求不嚴(yán)格，能利用多種碳源，但利用能力有差異，利用能力由高到低依次為麥芽糖，果糖，葡萄糖，蔗糖，淀粉，甘露醇，乳糖，甘油，瓊脂對(duì)照(表1)。

表1 不同碳源對(duì)鐵皮石斛炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

注：鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫(xiě)字母者表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.5.4 不同碳源培養(yǎng)基上菌落特征 膠孢炭疽菌在葡萄糖、蔗糖、果糖培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀、菌絲生長(zhǎng)茂盛，葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中絮狀菌落邊緣比較整齊；果糖培養(yǎng)基中菌落邊緣呈折扇狀。在麥芽糖、淀粉培養(yǎng)基中的絮狀菌落菌絲茂盛，邊緣整齊，呈現(xiàn)灰青色。在乳糖培養(yǎng)基上菌落灰青色，氈狀，質(zhì)密，邊緣整齊。在甘油培養(yǎng)基上菌落青綠色，氈狀，質(zhì)密，邊緣整齊。在甘露醇培養(yǎng)基上菌落乳白色，氈狀，邊緣整齊。所有碳源培養(yǎng)基上均無(wú)明顯輪紋產(chǎn)生。在對(duì)照培養(yǎng)基上菌落稀疏，白色，生長(zhǎng)較差(圖6)。

圖6 不同碳源培養(yǎng)基上鐵皮石斛炭疽病原菌菌落特征

2.5.5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 硫酸銨、氯化銨作為氮源培養(yǎng)基明顯不利于膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)(P<0.05)，其他供試氮源均對(duì)該菌菌絲生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。說(shuō)明該菌可以利用多種氮源，但對(duì)不同氮源利用能力存在顯著差異，由高到低依次為蛋白胨，酵母膏，硝酸鉀，尿素，硝酸鈉，瓊脂對(duì)照，硫酸銨，氯化銨。(表2)

2.5.6 不同氮源培養(yǎng)基上的菌落特征 膠孢炭疽菌在對(duì)照瓊脂培養(yǎng)基上菌落灰黑色，菌絲質(zhì)密，生長(zhǎng)不旺盛；在硝酸鉀培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀、菌絲生長(zhǎng)茂盛，邊緣整齊；在蛋白胨和酵母膏培養(yǎng)基上菌落灰白色，絮狀，菌絲生長(zhǎng)旺盛，邊緣整齊；尿素培養(yǎng)基上菌落白色，絮狀、菌絲生長(zhǎng)茂盛，邊緣整齊；硝酸鈉培養(yǎng)基上菌落白色，絮狀、菌絲生長(zhǎng)茂盛，邊緣整齊；在硫酸銨、氯化銨培養(yǎng)基上菌落白色，質(zhì)密，邊緣略顯褶皺。所有氮源培養(yǎng)基上均無(wú)明顯輪紋產(chǎn)生(圖7)。

表2 不同氮源對(duì)鐵皮石斛炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

注：鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫(xiě)字母者表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖7 氮源培養(yǎng)基上石斛炭疽病菌特征

3 結(jié)論與討論

對(duì)于石斛炭疽病病原的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，張翊 等[6]對(duì)采自金釵石斛的病原進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為病原為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。膠孢炭疽菌是引起多種經(jīng)濟(jì)作物炭疽病的病原菌，在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)生的柱花草炭疽病、杧果炭疽病、橡膠炭疽病等都是由真菌引起的[5-13]。鐵皮石斛炭疽病，在國(guó)內(nèi)只見(jiàn)王艷對(duì)鐵皮石斛與炭疽菌的互作機(jī)制作過(guò)研究[14]，其他報(bào)道較少。能準(zhǔn)確鑒定病原炭疽病菌(Colletotrichum) 對(duì)于植物炭疽病的防控相當(dāng)重要，傳統(tǒng)的病原鑒定方法采用形態(tài)學(xué)鑒定，但其形態(tài)特性因?qū)嶒?yàn)方法和條件不同而受到影響，鑒定結(jié)果常有偏差，現(xiàn)代分子生物學(xué)基于rDNA-ITS測(cè)序?yàn)椴≡臏?zhǔn)確鑒定提供了穩(wěn)定而可靠的方法，本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS 測(cè)序鑒定方法相結(jié)合，證實(shí)鐵皮石斛炭疽病的病原菌為半知菌亞門(mén)腔孢綱黑盤(pán)孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

膠孢炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)溫度范圍為10～35 ℃，最適生長(zhǎng)溫度范圍為15～30 ℃；15～28 ℃時(shí)，菌絲直徑隨溫度升高逐漸變大，至28 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大；28～35 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)隨溫度升高而急劇下降，35 ℃下菌絲生長(zhǎng)已非常緩慢。該菌落生長(zhǎng)的最高溫度與黃炳金 等[15]對(duì)銀杏炭疽病菌及雷百戰(zhàn) 等[16]對(duì)新疆葡萄炭疽病菌的研究結(jié)果基本一致。鐵皮石斛炭疽菌在pH值為3～11的PDA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但菌絲最適生長(zhǎng)pH值為5～6，酸性條件更適宜其產(chǎn)孢，pH值為3～4時(shí)產(chǎn)孢量最大，此結(jié)果與楊葉[17]對(duì)香蕉果實(shí)炭疽菌的研究是一致的。

膠孢炭疽菌對(duì)各種碳源均有較好的利用能力，對(duì)碳源要求不嚴(yán)格，在供試的幾種碳源中菌絲生長(zhǎng)良好，但以麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖最利于產(chǎn)生菌絲。在不同氮源條件下，蛋白胨是最利于菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)生分生孢子的氮源；硫酸銨、氯化銨作為氮源的培養(yǎng)基明顯不利于石斛炭疽菌菌絲生長(zhǎng)。

從膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性室內(nèi)測(cè)定可預(yù)知，田間溫度變化與石斛炭疽病流行有密不可分的關(guān)系，高溫高濕的氣候條件有利于該病流行。因此，高溫高濕季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)該病的防控工作。通過(guò)對(duì)石斛炭疽病病原鑒定及其病原的生物學(xué)特性研究，可為今后研究該病的內(nèi)部發(fā)病機(jī)制如蛋白組學(xué)、基因組學(xué)等方面提供參考。