李長(zhǎng)濱，楊盛茹，楊謹(jǐn)旭，吳 迪

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

近年來(lái)，食品安全和農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直被廣泛關(guān)注，食品和農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目日益增多，限量要求日益嚴(yán)格，針對(duì)單一類型農(nóng)藥的分析方法已經(jīng)很難適應(yīng)新的分析要求。因此，有必要找到一種樣品前處理簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確的農(nóng)藥多殘留分析方法。

QuEChERS（快速Q(mào)uick，簡(jiǎn)單Easy，廉價(jià)Cheap，高效Effective，耐用Rugged，安全Safe）方法具有快速高效、溶劑使用量少、操作簡(jiǎn)便、安全可靠等特點(diǎn)[1-3]，最初被廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留的測(cè)定，后被應(yīng)用到更多的樣品檢測(cè)和基質(zhì)中[4-6]，是農(nóng)藥殘留快速前處理技術(shù)的首要選擇[7-8]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）具有靈敏度高、選擇性好、適用范圍廣的特點(diǎn)，越來(lái)越多地被應(yīng)用于高通量分析中[9-11]。漿果類水果富含維生素和強(qiáng)抗氧化劑，能延緩衰老，深受消費(fèi)者喜歡，然而，由于種植過(guò)程中農(nóng)藥使用不規(guī)范等原因，容易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，甚至出現(xiàn)使用違禁農(nóng)藥的情況，因此對(duì)漿果類水果農(nóng)藥殘留監(jiān)管和檢測(cè)方法的研究意義重大[12]。

在漿果分析中，其基質(zhì)中的主要干擾物為脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物、甾醇、脂類和色素等[19-20]，乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）主要吸附基質(zhì)中的碳水化合物、有機(jī)酸、脂肪酸、酚類和少量的色素；石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）主要去除色素、甾醇類和非極性干擾物；C18則主要去除脂肪和脂類等非極性干擾物。但有些農(nóng)藥在GCB和C18中損失較大。故選擇合適的分散劑種類和用量以達(dá)到較好的回收和凈化目的顯得尤為重要。目前漿果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]、液相色譜-熒光法聯(lián)用[15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用[17-18]等方法，但使用QuEChERS前處理結(jié)合LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)漿果中有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和三唑類3大類10種農(nóng)藥的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以有機(jī)磷類：氧樂(lè)果、敵百蟲、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、三唑磷；氨基甲酸酯類：涕滅威、克百威；三唑類：三唑酮、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑10種農(nóng)藥作為檢測(cè)目標(biāo)，以QuEChERS方法為前處理手段，分別評(píng)價(jià)了提取溶劑、分散固相萃取材料以及不同基質(zhì)對(duì)藍(lán)莓和葡萄中常見(jiàn)農(nóng)藥殘留測(cè)定的影響，優(yōu)化建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)漿果中多種農(nóng)殘的方法，對(duì)其他植物和水果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)也具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、丙酮（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；甲酸（色譜純）：美國(guó)Fluka公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、倍半水合檸檬酸二鈉、醋酸鈉（分析純）：天津科密歐試劑公司；10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，純度均在97%以上；分散劑填料PSA、GCB、C18：均購(gòu)自上海安譜公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters UPLC-TQS Micro三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI））：美國(guó)Waters公司；Milli-Q超純水器：美國(guó)Millipore公司；10～5000μL移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；ME204E分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；IKA MS3小型旋渦混勻器：德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 液相條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速為0.3 mL/min；離子源為ESI正離子模式；電離電壓為5 500 V，掃描方式為多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)方式（multiple reaction monitoring，MRM）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液∶甲醇（98∶2，V/V），流動(dòng)相B：0.1%甲酸甲醇，具體梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：離子源為ESI+；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；錐孔電壓50 V；去溶劑溫度500℃；去溶劑氣流量1 000 L/h，各種農(nóng)藥優(yōu)化母離子和子離子及對(duì)應(yīng)錐孔電壓值見(jiàn)表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)主要參數(shù)Table 2 Main parameters of multiple reaction monitoring

1.3.3 分散劑種類選擇

根據(jù)查閱文獻(xiàn)[21-23]結(jié)合QuEChERS常用分散劑，本研究中分別選擇PSA、GCB、C18 3種分散劑進(jìn)行優(yōu)化比較實(shí)驗(yàn)，分別評(píng)價(jià)了不同PSA添加量、GCB添加量及C18添加量條件下的回收率，得到最優(yōu)的添加組合。

具體優(yōu)化過(guò)程按照以下方法進(jìn)行。稱取10 g（精確至0.01 g）粉碎混勻的試樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min后加入4.0 g無(wú)水硫酸鎂、1.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g倍半水合物檸檬酸二鈉，水平振蕩器中振蕩5.0 min，然后以4 500 r/min離心5.0 min，取1 mL上清液于2 mL高速離心管中加入150 mg無(wú)水硫酸鎂、分別添加不同量分散劑PSA、GCB和C18（具體添加量及組合見(jiàn)表3）；渦旋1 min，然后以10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL在40 ℃下氮?dú)猓∟2）吹干，用流動(dòng)相（流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=60∶40）定容至1 mL，溶解后過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

表3 分散劑添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for dispersing agent addition optimization

1.3.4緩沖溶液的選擇

本實(shí)驗(yàn)使用乙腈萃取，然后使用無(wú)水硫酸鎂從樣品中鹽析出水分，用NaCl和緩沖檸檬酸鹽使液體分層，然后取一部分上清，按照分散固相萃取步驟進(jìn)一步凈化，用檸檬酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液進(jìn)行選擇優(yōu)化。

稱取10 g（精確至0.01 g）粉碎混勻的試樣于50 mL離心管中，分別加入10 mL乙腈或10 mL1%醋酸乙腈，渦旋1 min后加入4.0 g無(wú)水硫酸鎂、1.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉或1.0 g醋酸鈉，在水平振蕩器中振蕩5.0 min后以4 500 r/min離心5.0 min，然后取1 mL上清液于2 mL高速離心管中并加入最優(yōu)分散劑組合以及150 mg無(wú)水硫酸鎂，渦旋1 min，然后以10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL在40℃條件下氮?dú)猓∟2）吹干，用1 mL混合液（流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=60∶40，V/V）定容，復(fù)溶后過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分散劑優(yōu)化結(jié)果

考察PSA、GCB、C18 3種分散劑凈化效果對(duì)樣品的凈化效果，分別衡量了3種分散劑的不同組合效果，首先通過(guò)單因素分析確定了PSA的最佳用量是50 mg，GCB的最佳用量是3.5mg，C18的最佳用量是50 mg，然后以10種農(nóng)藥的平均回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)確定分散劑的添加組合以及用量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 分散劑添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for dispersing agent addition optimization

由表4中極差值可知，PSA分散劑添加量對(duì)試驗(yàn)影響因素最大，其次為GCB分散劑，C18分散劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最小。由K值可知分散劑最優(yōu)組合為A2B2C2，即PSA50mg，GCB 2.5 mg和C18 50 mg。此優(yōu)化條件下進(jìn)行基質(zhì)的凈化，平均回收率達(dá)75.38%。

2.2 緩沖溶液的選擇

不同緩沖溶液對(duì)不同農(nóng)殘回收率測(cè)定結(jié)果的影響見(jiàn)表5。由表5可知，檸檬酸鹽緩沖體系條件下，同一種類農(nóng)藥殘留的回收率相對(duì)比較穩(wěn)定，10種農(nóng)殘的平均回收率范圍為64.42%～84.50%，而醋酸鹽緩沖體系下即使同一類農(nóng)藥殘留回收率相差較大，10種農(nóng)殘的平均回收率范圍為52.88%～97.74%，對(duì)比可知檸檬酸鹽系統(tǒng)效果較好。

表5 不同緩沖體系對(duì)回收率的影響Table 5 Effect of different buffer systems on recovery rate

2.3 方法評(píng)價(jià)

向葡萄和藍(lán)莓基質(zhì)中分別添加10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg 3個(gè)濃度的農(nóng)藥標(biāo)品，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)。樣品通過(guò)加標(biāo)基質(zhì)校準(zhǔn)曲線來(lái)定量，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)?；厥章屎途芏葦?shù)據(jù)見(jiàn)表6。通過(guò)表6可知，測(cè)定藍(lán)莓和葡萄中10種農(nóng)藥殘留的加標(biāo)回收率分別為95.31%～111.26%和90.37%～116.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.90%～4.16%和0.80%～5.09%。說(shuō)明該方法能夠滿足測(cè)定的要求。

表6 不同農(nóng)殘回收率和精密度結(jié)果Table 6 Recovery and precision results of different pesticide residues

續(xù)表

農(nóng)藥名稱 添加水平/（μg·kg-1）藍(lán)莓平均回收率/%RSD/%葡萄平均回收率/%RSD/%敵百蟲甲基對(duì)硫磷對(duì)硫磷三唑酮戊唑醇三唑磷苯醚甲環(huán)唑10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 95.31 100.98 101.62 107.39 111.26 100.40 105.47 109.70 98.87 103.83 103.86 96.83 105.00 104.97 106.00 106.54 108.64 97.79 104.73 105.08 99.88 0.90 3.14 2.40 4.16 3.76 2.10 3.62 1.17 2.02 1.80 1.13 1.61 1.69 0.75 0.40 2.02 1.34 1.17 2.27 2.07 1.67 108.73 109.56 116.20 100.89 93.10 112.70 98.18 90.37 105.38 97.15 98.49 109.50 99.19 107.28 108.95 97.12 99.22 109.61 100.56 105.64 107.23 4.99 2.74 1.41 1.98 4.57 1.67 5.09 3.71 0.80 4.09 2.89 1.65 3.67 1.90 1.54 4.21 3.06 0.95 4.46 3.34 1.24

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

在選定的色譜質(zhì)譜條件下,對(duì)當(dāng)?shù)厥惺鄣?0份番茄樣品、10份草莓樣品和5份樹(shù)莓樣品進(jìn)行檢測(cè)，涕滅威等10種農(nóng)藥的殘留量均低于檢測(cè)限，均未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)采用QuEChERS前處理方法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用建立了測(cè)定漿果中10種農(nóng)藥殘留的方法。通過(guò)優(yōu)化不同分散劑組合及比例、緩沖體系等得到了最優(yōu)的處理?xiàng)l件，較好地排除了樣品基質(zhì)的干擾，適用的樣品基質(zhì)范圍廣，簡(jiǎn)化了操作步驟，凈化效果好且回收率符合要求。本研究方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于大批漿果中的有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和三唑類農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。