張大威，陳向陽，査國春

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

正常關(guān)節(jié)軟骨組織由軟骨細(xì)胞及分泌的胞外基質(zhì)組成，膠原蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖是胞外基質(zhì)的主要成分［1］.透明質(zhì)酸可連接軟骨組織中基質(zhì)蛋白聚糖、多糖等大分子蛋白，在維持軟骨正常生理特征中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］.透明質(zhì)酸合成酶是調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸分泌的主要蛋白，包括透明質(zhì)酸合成酶1和2共同形成的大分子量透明質(zhì)酸以及透明質(zhì)酸3形成的低分子量透明質(zhì)酸［3］;其中透明質(zhì)酸合成酶2在軟骨細(xì)胞中作用最明顯［4］.IL-18在膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中呈高表達(dá)，且與 IFN-γ，IL-6，TNF-α 等炎癥因子表達(dá)水平密切相關(guān)，共同參與了炎癥過程［5］.骨橋蛋白屬于小整聯(lián)蛋白結(jié)合配體N-連結(jié)糖蛋白家族，廣泛分布于礦化骨組織中，軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等骨細(xì)胞均能分泌骨橋蛋白.相關(guān)研究［6］顯示:骨橋蛋白介導(dǎo)了正常軟骨的生長代謝和修復(fù)過程.本研究在體外培養(yǎng)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)，探討對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子以及透明質(zhì)酸合成酶表達(dá)的影響.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取28例2016年6月—2018年3月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者，均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的骨關(guān)節(jié)炎診治指南中的標(biāo)準(zhǔn)診斷為原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者;近3個(gè)月內(nèi)無膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物注射治療史，無骨關(guān)節(jié)炎口服藥物治療史;排除創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等非原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者.其中，男16例，女12例;年齡57～75歲，平均(66.28±4.02)歲.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本取材均告知患者，并簽署知情同意書.

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(上海斯信生物科技有限公司);骨橋蛋白siRNA由上海拜力生物科技有限設(shè)計(jì)并合成;脂質(zhì)體2000、重組人骨橋蛋白(艾美捷科技有限公司);炎癥因子酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(北京貝爾生物工程股份有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

術(shù)中取脛骨平臺(tái)側(cè)標(biāo)本，磷酸緩沖液洗滌后用無菌手術(shù)剪將標(biāo)本表面軟骨塊剪1 mm大小，裝入離心管中，加入Ⅱ型膠原酶，混合均勻后放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，次日將離心管中混合液過60目濾網(wǎng)，將濾液轉(zhuǎn)入20 mL離心管中，使用磷酸緩沖液定容至15 mL，1 000 r/min離心10 min，收集下層含軟骨細(xì)胞的濾液.使用含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×109/L，分別裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋瓶底80%以上后進(jìn)行傳代.

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定

將脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染骨橋蛋白siRNA置于6孔板中，轉(zhuǎn)染濃度為 100 nmol/L.將 siRNA脂質(zhì)體2000混合液加入DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)6 h后，更換為DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h為siRNA組，熒光顯微鏡下觀察帶熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率.同時(shí)設(shè)置不進(jìn)行任何干預(yù)的空白對(duì)照組;1 mg/L重組人骨橋蛋白處理24 h的為重組人骨橋蛋白刺激組.

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子檢測(cè)

將3組軟骨細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入150 μL DMEM完全培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè) IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α 水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行.

1.3.4 RT-PCR 檢測(cè)

Trizol法提取膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.透明質(zhì)酸合成酶1、透明質(zhì)酸合成酶2、透明質(zhì)酸合成酶3及內(nèi)參β-actin引物合成由上海合星生物科技有限公司完成，透明質(zhì)酸合成酶1引物序列:上游5'-ACTTCCGATGG GTCATAGCG-3'，下游 5'-AGAACTCCGGACCATGTTGG-3';透明質(zhì)酸合成酶 2引物序列:上游 5'-CAGCAGG AGTCGGACAGACA-3'，下游 5'-GAGGAGGAACCTT AGTGTC-3';透明質(zhì)酸合成酶3引物序列:上游5'-AACTTCCGGCACAT GTACTG-3'，下游 5'-CTCCTC CTAGGGGTTCATCC-3';β-actin引物序列:上游5'-AAGTATTGACAGGAAGGGTG-3'，下游 5'-GTCCTT GAAAGGTTTCAGTC-3'.反應(yīng)條件:94 ℃ 30 s，94 ℃5 s，72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，延伸 72 ℃ 10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算透明質(zhì)酸合成酶1、透明質(zhì)酸合成酶2、透明質(zhì)酸合成酶3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

1.3.5 Western blot檢測(cè)

RIPA提取膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，行 SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加兔抗人骨橋蛋白單克隆抗體(1∶200)，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫反應(yīng)1 h，滴加ECL顯色液，避光顯影，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算各條帶灰度值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染情況鑒定

原代培養(yǎng)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中貼壁成團(tuán)生長，細(xì)胞呈梭形、三角形、橢圓形;熒光顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞已多數(shù)轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染效率＞90%.轉(zhuǎn)染48 h后，空白對(duì)照組、siRNA組、重組人骨橋蛋白刺激組中膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的骨橋蛋白mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中siRNA組骨橋蛋白mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，重組人骨橋蛋白刺激組明顯提升.見圖 1～2，表 1.

圖1 膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染情況觀察Fig.1 Observation of chondrocyte morphology and transfection in knee osteoarthritis

圖2 各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)水平的Western blot電泳結(jié)果Fig.2 Western blot electrophoresis of osteopontin expression in chondrocytes of knee osteoarthritis

表1 各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.1 Relative expression of osteopontin and osteopontin in chondrocytes of knee osteoarthritis in each group

表1 各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.1 Relative expression of osteopontin and osteopontin in chondrocytes of knee osteoarthritis in each group

注:與空白對(duì)照組比較，a:P＜0.05;與 siRNA 組比較，b:P＜0.05

?

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平檢測(cè)

siRNA 組細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明顯低于空白對(duì)照組、重組人骨橋蛋白刺激組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);重組人骨橋蛋白刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明顯高于空白對(duì)照組、siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).見表 2.

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平Tab.2 IL-18，IFN-γ，IL-6 and TNF-α levels in cell culture medium of each group，ρ/(ng·mL－1))

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平Tab.2 IL-18，IFN-γ，IL-6 and TNF-α levels in cell culture medium of each group，ρ/(ng·mL－1))

注:與空白對(duì)照組比較，a:P＜0.05;與 siRNA 組比較，b:P＜0.05

?

2.3 各組透明質(zhì)酸合成酶mRNA表達(dá)水平

siRNA組透明質(zhì)酸合成酶1、透明質(zhì)酸合成酶2、透明質(zhì)酸合成酶3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、重組人骨橋蛋白刺激組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);重組人骨橋蛋白刺激組透明質(zhì)酸合成酶1、透明質(zhì)酸合成酶2、透明質(zhì)酸合成酶3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組、siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).見表 3.

表3 各組透明質(zhì)酸合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.3Relative expression of hyaluronic acid synthase mRNA in each group

表3 各組透明質(zhì)酸合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.3Relative expression of hyaluronic acid synthase mRNA in each group

注:與空白對(duì)照組比較，a:P＜0.05;與 siRNA 組比較，b:P＜0.05

?

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎多發(fā)于老年人群，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［7］.膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程受多因素共同調(diào)控，引發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡.研究［8］發(fā)現(xiàn):IL-18是關(guān)節(jié)炎性病變?cè)缙诘闹饕?xì)胞因子，關(guān)節(jié)滑膜液中IL-18可直接接觸T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌TNF-α;同時(shí)IL-18誘導(dǎo)生成的IFN-γ在關(guān)節(jié)滑膜液中可刺激IL-6，PGE2等炎癥因子分泌，而TNF-α，IFN-γ是介導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎等多種炎癥疾病發(fā)生、發(fā)展的炎癥因子［9］.骨橋蛋白是由T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的可溶性糖蛋白，廣泛分布于骨骼組織、平滑肌、腎臟組織以及具有分泌功能的腺體，其中以骨骼組織含量最高［10］.骨橋蛋白通過胞外基質(zhì)中RGD序列與細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞黏附和趨化［11］;骨組織中骨橋蛋白高表達(dá)可能參與骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)、軟骨內(nèi)骨化等多種病理過程［12］.本研究通過原代培養(yǎng)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示:骨橋蛋白表達(dá)下調(diào)后膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α 水平明顯下降，而重組人骨橋蛋白刺激組 IL-18，IFN-γ，IL-6，TNF-α水平明顯上升.提示骨橋蛋白能夠上調(diào)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)，破壞關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥因子間的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致軟骨退變和關(guān)節(jié)損傷加重.但骨橋蛋白在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中通過哪些信號(hào)通路激活炎癥因子分泌仍需進(jìn)一步深入研究.

透明質(zhì)酸是廣泛存在于關(guān)節(jié)軟骨、晶狀體、皮膚真皮層等組織中一種葡聚糖醛酸，是關(guān)節(jié)滑液中的主要成分［13］.透明質(zhì)酸可通過影響胞外基質(zhì)的形成以及直接作用于細(xì)胞來影響細(xì)胞行為，對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持及關(guān)節(jié)潤滑具有重要影響.同時(shí)，透明質(zhì)酸還具有抑制IFN-γ，TNF-α等炎癥因子的活性，可降低關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)［14］.相關(guān)研究［15］顯示:骨橋蛋白可影響透明質(zhì)酸合成酶表達(dá)水平及透明質(zhì)酸濃度，但針對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)對(duì)透明質(zhì)酸合成酶影響的研究報(bào)道仍十分少見，且無法明確透明質(zhì)酸濃度的改變受哪種透明質(zhì)酸合成酶的影響最顯著.研究［16］已發(fā)現(xiàn):人體透明質(zhì)酸合成酶基因包括3種，具有高度的結(jié)構(gòu)同源性，具有約80%的相同序列;但其穩(wěn)定性存在差異，透明質(zhì)酸的延伸效率及生成長度也不同［17］.

本研究顯示:siRNA組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中透明質(zhì)酸合成酶表達(dá)水平明顯升高，重組人骨橋蛋白刺激組明顯下降，且透明質(zhì)酸合成酶2在各組細(xì)胞中表達(dá)水平變化最明顯，透明質(zhì)酸合成酶1、透明質(zhì)酸合成酶3表達(dá)水平變化幅度相似.提示下調(diào)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)可提升透明質(zhì)酸合成酶表達(dá)水平，進(jìn)而提升透明質(zhì)酸分泌量，改善關(guān)節(jié)潤滑程度并抑制炎癥因子分泌，改善膝骨關(guān)節(jié)炎病情.