王永霞，馬 娜，鐘興明，崔 蓉，苗竹林

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510600； 2.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 生殖免疫遺傳中心,廣州510600；3.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院,廣州 510610)

卵巢早衰是指女性40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退的現(xiàn)象，伴有高促性腺激素和低雌激素水平。卵巢早衰的病因非常復(fù)雜，目前研究已經(jīng)明確的發(fā)病因素包括遺傳性、自身免疫性、感染性、醫(yī)源性、環(huán)境及心理等。80%以上的患者發(fā)病原因不明確,大多數(shù)患者得不到相應(yīng)的病因診斷[1-4]。中藥菟絲子是中醫(yī)溫補(bǔ)腎陽(yáng)的要藥，常用于治療婦科內(nèi)分泌疾病,療效確切[5-7]。菟絲子是一種旋花科植物菟絲子或大菟絲子的成熟種子，主要生物活性成分為菟絲子總黃酮(total flavonoids from semen cuscutae,TFSC)。多項(xiàng)藥理研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子及TFSC在改善人體的生殖內(nèi)分泌功能、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管和抗突變等方面都有較好的作用，在改善和提高人體生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)功能方面的作用更加顯著[8-11]。王曉紅[12]研究發(fā)現(xiàn)，以菟絲子為主的抗衰復(fù)巢湯聯(lián)合激素補(bǔ)充療法能有效治療卵巢早衰，提高患者的生殖激素水平。但單獨(dú)應(yīng)用TFSC對(duì)卵巢早衰的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立成熟的大鼠卵巢早衰模型，觀察TFSC對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢功能的作用，為T(mén)FSC在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑TFSC的提取與分離技術(shù) 取菟絲子藥材粉碎過(guò)篩后經(jīng)石油醚脫脂，加75%乙醇6倍量，加熱回流提取2次，每次2 h。濾過(guò)，合并濾液，減壓回收75%乙醇，加水稀釋至0.1 g生藥/mL，置已經(jīng)處理好的D101大孔樹(shù)脂柱中，以水洗至流出液近無(wú)色，棄去，再以梯度乙醇、水從低濃度至高濃度梯度洗脫，收集35%～65%濃度的洗脫液，減壓回收乙醇合并濃縮成稠膏狀，減壓干燥，粉碎，過(guò)篩即得總黃酮。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模 200～250 g雌性健康SD大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d，連續(xù)5～10 d做陰道涂片，有動(dòng)情周期的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。90只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、雌激素對(duì)照組以及TFSC低、中、高劑量(35、70、140 mg/kg)組，每組15只，除正常組不造模外，其余均造模，采用一次性的腹腔注射環(huán)磷酰胺(120 mg/kg)聯(lián)合皮內(nèi)注射白消安(12 mg/kg)制造大鼠卵巢早衰模型[13]。注射結(jié)束后，每天上午9：00～10：00取大鼠陰道脫落細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察動(dòng)情周期變化，若出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長(zhǎng)、動(dòng)情期消失等現(xiàn)象即為造模成功[14]。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 所有大鼠造模成功后同時(shí)給藥，按照TFSC低、中、高劑量組(35、70、140 mg/kg)灌胃，正常組和模型組均給予同體積的0.9%NaCl注射液。雌激素對(duì)照組給予雌二醇溶液(0.3 mg/kg)灌胃。灌胃給藥10 d后處死所有大鼠，稱重，剖腹取出卵巢，取血清于-20 ℃冰箱保存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 動(dòng)情周期的觀察 采用陰道脫落細(xì)胞涂片觀察大鼠的動(dòng)情周期，用消毒棉簽插入大鼠陰道約0.5 cm，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)2～3圈，均勻涂在潔凈的載玻片上，巴氏染色后，顯微鏡下觀察。觀察標(biāo)準(zhǔn)如下。①動(dòng)情前期：絕大多數(shù)細(xì)胞為橢圓形的有核上皮細(xì)胞。②動(dòng)情期：鏡下絕大多數(shù)細(xì)胞為片狀無(wú)核角化細(xì)胞。③動(dòng)情后期：鏡下主要為白細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞、片狀角化細(xì)胞。④動(dòng)情間期：鏡下絕大多數(shù)細(xì)胞為白細(xì)胞[15]。

1.4.2 性激素水平 取大鼠血清采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行雌二醇、卵泡刺激素測(cè)定。

1.4.3 卵巢指數(shù) 取出卵巢后，采用電子天平稱重并計(jì)算卵巢指數(shù)[16]。卵巢指數(shù)=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%。

1.4.4 病理形態(tài)學(xué)觀察和卵泡計(jì)數(shù) ①取大鼠卵巢，用10%甲醛溶液浸泡固定后進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟、包埋后制成蠟塊保存；②將組織塊切成 3～4 μm石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色法染色，顯微鏡下觀察卵巢的形態(tài)學(xué)變化；觀察卵泡發(fā)育，計(jì)數(shù)卵泡數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 TFSC對(duì)卵巢早衰大鼠動(dòng)情周期的影響 除正常組，模型組、雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組大鼠的動(dòng)情周期均發(fā)生紊亂，其中模型組表現(xiàn)為持續(xù)延長(zhǎng)的動(dòng)情間期、無(wú)動(dòng)情前期或動(dòng)情期。正常組、雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組的動(dòng)情期分別為4～5 d、5～6 d、7～8 d、6～7 d、5～6 d。

2.2 TFSC對(duì)卵巢早衰大鼠性激素水平的影響 各組大鼠的雌激素水平均不同程度的降低，其中模型組、TFSC低劑量組低于正常組(P<0.05)，雌激素對(duì)照組及TFSC中、高劑量組雌二醇水平高于模型組(P<0.05)；各組大鼠卵泡刺激素水平均有不同程度的降低，其中，模型組、雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組卵泡刺激素水平低于正常組，TFSC低劑量組低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 TFSC對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢指數(shù)的影響 各組大鼠體重、卵巢指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與正常組比較，模型組及雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組的體重、卵巢指數(shù)均降低(P<0.05)，但與模型組比較,TFSC高劑量組大鼠體重、卵巢指數(shù)均升高(P<0.05)，與雌激素對(duì)照組比較，TFSC低劑量組體重升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別只數(shù)雌二醇(pg/mL)卵泡刺激素(mU/mL)正常組1595.21±21.120.036±0.003模型組1554.87±25.05a0.026±0.002a雌激素對(duì)照組1578.87±30.04b0.025±0.003aTFSC低劑量組1565.61±27.61ab0.023±0.001abTFSC中劑量組1569.83±23.93b0.026±0.002aTFSC高劑量組1579.92±26.11b0.027±0.003aF值4.33951.420P值0.002<0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

組別只數(shù)體重(g)卵巢指數(shù)(×10-1)正常組15263.65±5.183.88±0.17模型組15232.23±4.15a2.87±0.13a雌激素對(duì)照組15257.12±3.37a3.15±0.19aTFSC低劑量組15255.22±4.02ac3.24±0.21aTFSC中劑量組15256.61±3.78a3.36±0.18aTFSC高劑量組15258.11±3.69ab3.54±0.15abF值108.57056.451P值<0.001<0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05；c與雌激素對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠的卵巢組織形態(tài)學(xué)及卵巢中卵泡計(jì)數(shù)比較 顯微鏡下觀察，正常組(圖1a)卵巢體積大，卵泡生長(zhǎng)活躍，可見(jiàn)各級(jí)卵泡分布，顆粒細(xì)胞層次多；黃體發(fā)育好，黃體細(xì)胞豐富。模型組(圖1b)卵巢萎縮明顯，卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增多，卵泡顆粒細(xì)胞層減少，黃體數(shù)量減少。雌激素對(duì)照組(圖1c)及TFSC低、中、高劑量組(圖1d～f)卵巢體積較模型組大，卵巢皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量初級(jí)卵泡及生長(zhǎng)卵泡，較多接近成熟卵泡，顆粒細(xì)胞層次多，黃體發(fā)育細(xì)胞較多。以用藥高劑量組最為明顯。各組大鼠總卵泡數(shù)、生長(zhǎng)卵泡、閉鎖卵泡/總卵泡比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組、雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組總卵泡數(shù)少于正常組，雌激素對(duì)照組及TFSC中、高劑量組多于模型組(P<0.05)；模型組、雌激素對(duì)照組及TFSC低、中劑量組生長(zhǎng)卵泡少于正常組，雌激素對(duì)照組及TFSC中、高劑量組多于模型組(P<0.05)；雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組閉鎖卵泡/總卵泡低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

a：正常組； b：模型組； c：雌激素對(duì)照組； d：TFSC低劑量組；e：TFSC中劑量組； f：TFSC高劑量組；→：生長(zhǎng)卵泡；▲：黃體；△：閉鎖卵泡；TFSC：菟絲子總黃酮

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢組織形態(tài)圖(蘇木素-伊紅染色，×100)

3 討 論

對(duì)病因不同的卵巢早衰患者,臨床普遍使用激素替代療法進(jìn)行治療，而卵巢早衰患者大多伴有生育問(wèn)題，對(duì)有生育要求的患者，如何改善提高卵巢功能已成為一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。近年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)卵巢早衰的治療也取得很大進(jìn)展，中醫(yī)在辨證治療上從肝腎入手,兼及氣血、痰濕等,促進(jìn)性腺軸正常功能的恢復(fù),提高卵巢功能,防止卵巢組織出現(xiàn)病理性改變,使性激素達(dá)到平衡[17]。張立[18]應(yīng)用補(bǔ)腎劑治療36例卵巢早衰患者,結(jié)果顯示患者的雌激素缺乏癥狀明顯減輕,有的甚至消失,生殖器萎縮得到有效改善,其中1例妊娠。進(jìn)一步說(shuō)明采用中醫(yī)藥治療能從根本上恢復(fù)臟腑、沖任的功能,從而使機(jī)體達(dá)到陰陽(yáng)平衡，臟腑和諧,氣血旺盛，進(jìn)一步恢復(fù)性腺軸功能,使卵巢功能早衰現(xiàn)象得到改善。

組別只數(shù)總卵泡數(shù)(個(gè))生長(zhǎng)卵泡(個(gè))閉鎖卵泡/總卵泡正常組1529.15±3.5122.89±4.190.21±0.07模型組1512.34±3.78a7.68±3.56a0.39±0.06雌激素對(duì)照組1525.88±3.23ab18.76±3.15ab0.25±0.09bTFSC低劑量組1518.92±3.19a13.69±4.10a0.30±0.03bTFSC中劑量組1522.97±3.54ab15.92±3.79ab0.28±0.09bTFSC高劑量組1524.74±3.49ab17.81±3.46b0.24±0.04bF值44.23428.70513.158P值<0.001<0.001 <0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

中藥菟絲子是常用的補(bǔ)腎中藥，在臨床上用單味中藥菟絲子治療性腺功能障礙也取得顯著療效[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸功能有多方面的作用：促進(jìn)下丘腦-垂體促性腺功能的恢復(fù),提高垂體及卵巢對(duì)激素的反應(yīng)性，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，增強(qiáng)卵巢激素受體的數(shù)目與功能，具有類雌激素樣活性[21-22]。說(shuō)明菟絲子能明顯改善生殖系統(tǒng)功能，尤其是提高卵巢功能。

本研究結(jié)果顯示，TFSC對(duì)卵巢早衰的大鼠動(dòng)情周期有明顯的恢復(fù)作用，尤其是TFSC高劑量組大鼠動(dòng)情周期與雌激素組基本無(wú)差別，說(shuō)明TFSC有類雌激素樣的作用。血清學(xué)激素檢測(cè)也說(shuō)明這一點(diǎn)，用藥組卵巢早衰大鼠體內(nèi)雌激素水平和卵泡刺激素的水平均有明顯提高，這與其他研究結(jié)果[23]一致，說(shuō)明TFSC能明顯恢復(fù)卵巢早衰大鼠的卵巢內(nèi)分泌功能。TFSC低、中、高劑量組大鼠的體重和卵巢指數(shù)雖與正常組比較略有降低，但也明顯高于模型對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明TFSC能一定程度低恢復(fù)卵巢功能，且TFSC高劑量組療效最顯著。這也與臨床應(yīng)用中藥菟絲子治療卵巢早衰取得療效的結(jié)果一致。

同時(shí)，通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果也印證了這一結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的卵巢明顯萎縮，卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，而雌激素對(duì)照組及TFSC低、中、高劑量組卵巢體積較模型組大，卵巢皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量初級(jí)卵泡及生長(zhǎng)卵泡，較多接近成熟卵泡，以TFSC高劑量組最為明顯。表明TFSC能明顯促進(jìn)卵巢早衰大鼠卵巢的各級(jí)卵泡發(fā)育，尤其是促使優(yōu)勢(shì)卵泡成熟化及顆粒細(xì)胞增殖，增加雌激素分泌，具有類雌激素樣的作用，對(duì)大鼠卵巢早衰有明顯的治療效果。

綜上所述，TFSC對(duì)大鼠卵巢早衰有明顯的療效，可以明顯提高大鼠血清雌激素水平，恢復(fù)卵巢早衰大鼠的動(dòng)情周期，促進(jìn)卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究補(bǔ)腎中藥菟絲子在臨床治療卵巢早衰提供了一定的研究基礎(chǔ)。