朱 珂，婁利霞，高永紅，國倩倩，吳丹丹，高毅潔，王曼曼，張冬梅

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700)

扶正化瘀方(Fuzheng Huayu recipe,FZHY)由丹參、桃仁、松花粉、五味子、絞股藍、蟲草菌絲6味中藥組成,最初是針對肝纖維化的“正虛血瘀”病機而設，具有活血化瘀、益氣扶正的功效[1]。本課題組前期研究表明,FZHY可降低心肌膠原表達，改善大鼠心肌梗死后心肌纖維化[2-3]。心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纖維化的主要效應細胞,其異常增殖并大量分泌細胞外基質(zhì)是心肌纖維化發(fā)生的重要病理學基礎[4]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子RNA，通過抑制mRNA的翻譯或促進mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達。miR-29是新近發(fā)現(xiàn)的一種與纖維化疾病緊密相關的小分子RNA家族,其中miR-29b可直接靶向調(diào)控細胞外基質(zhì)相關蛋白基因的表達[5]，并且可以作為轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads通路的上游因子調(diào)控心肌纖維化[6]，具有抗心肌纖維化的潛能。本研究在前期實驗的基礎上，擬采用差速貼壁法提取乳鼠原代CFs,觀察FZHY對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘導的CFs增殖、凋亡和miR-29b-5p表達的影響,在體外水平進一步探討FZHY抗心肌纖維化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3 日齡健康Wistar大鼠(雌雄不限),共20只,由北京維通利華實驗動物技術有限公司購進,SPF級,許可證編號:SCXK(京)2016-0006。

1.2 試劑與耗材 FZHY浸膏(上海黃海制藥有限責任公司提供)由丹參8 g、蟲草4 g、桃仁2 g、絞股藍6 g、松花粉2 g、五味子2 g六味中藥組成，得膏率為13.75%，每100毫克浸膏粉溶于1 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，用含2%胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium)培養(yǎng)基稀釋1 000倍后使用，Neonatal Heart Dissociation Kit(美國美天旎公司，貨號：130-098-373),胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：10099-141)，波形蛋白抗體(美國博士德公司，貨號：BM0135)，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(美國博士德公司，貨號：BM4172)，細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)(中國東仁化學科技有限公司，貨號：CK04),AngⅡ(中國中肽生化有限公司，貨號：CJ-04-01164)，細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司，貨號：KGP902)，miRcute miRNA Isolation Kit(中國TIANGEN公司，貨號：DP501)，miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(中國TIANGEN公司，貨號：KR211-02)，miRcute Plus miRNA aPCR Kit(中國TIANGEN公司，貨號：FP411-02)。

1.3 儀器 超凈工作臺(新加坡ESCO公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司),酶標儀(中國Rayto公司),全自動組織處理系統(tǒng)(美國美天旎公司)，IMT-2倒置顯微鏡(日本Olympus公司), 4 ℃低溫高速離心機(美國Thermo公司)，Agilent Mx3000P PCR儀(美國ABI公司)，紫外分光光度計(美國Pharmacia Biotech公司)。

1.4 CFs的培養(yǎng)和鑒定 根據(jù)乳鼠心臟分離試劑盒說明書操作，無菌條件下取Wistar乳鼠心臟，采用差速貼壁法提取CFs。待CFs生長近融合狀態(tài)時以1∶2傳代，實驗用第3～4代CFs。在倒置顯微鏡下觀察CFs形態(tài)，采用免疫細胞化學染色法鑒定CFs,步驟按免疫細胞化學試劑盒說明書進行。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力 用10%完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×104/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μL。細胞24 h貼壁后,換無血清DMEM繼續(xù)孵育24 h,使CFs處于同步生長休止期。按如下方案分組:空白對照組(2% FBS-DMEM)、DMSO對照組(0.1% DMSO)、AngⅡ組(10-7mol/L AngⅡ)、25 μg/mL FZHY組(10-7mol/L AngⅡ+25 μg/mL FZHY)、50 μg/mL FZHY組(10-7mol/L AngⅡ+50 μg/mL FZHY)和100 μg/mL FZHY組(10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY)，每組設6個復孔，干預48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,在酶標儀上450 nm處測定各孔的光密度(optical density,OD)值 。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 用10%完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為7.5×104/mL, 接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔2 mL。細胞24 h貼壁后，換無血清DMEM繼續(xù)孵育24 h。結(jié)合預實驗結(jié)果,按如下方案分組:空白對照組(2% FBS-DMEM)、AngⅡ組(10-7mol/L)、FZHY組(10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY)，每組設6個復孔，另設1孔為陰性對照組(10%FBS-DMEM)，干預48 h。按照細胞凋亡檢試劑盒說明書操作，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞,磷酸緩沖鹽溶液洗兩次，300×g離心5 min,棄上清；加入500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細胞，并將細胞懸液移入5 mL流式管中；空白對照組、AngⅡ組和FZHY組每孔分別加入5 μL 膜連蛋白V-熒光素異硫氰酸酯和5 μL碘化丙啶混勻，陰性對照組不加，于室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀進行檢測。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測細胞miR-29b-5p的表達 用10%完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為7.5×104/mL,接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔 2 mL。細胞24 h貼壁后，換無血清DMEM,繼續(xù)孵育24 h。按如下方案分組:空白對照組(2% FBS-DMEM)、Ang Ⅱ組(10-7mol/L)、FZHY組(10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY)，每組設6個復孔，干預48 h。棄上清,取細胞層用miRcute miRNA Isolation Kit提取miRNA,用紫外分光光度計進行260 nm和280 nm處吸光度值測量。按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說明書，建立反轉(zhuǎn)錄體系將miRNA反轉(zhuǎn)為cDNA。根據(jù)miRcute Plus miRNA aPCR Kit說明書操作，將聚合酶鏈反應條件設定為95 ℃預變性15 min→94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s共40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參進行熒光定量。引物序列如下，miR-29b-5p：5′-ATGGTTCGTGCGCTGGTTTCACATGGTGG-3′；U6：5′-CAAGGATGACACGCAAATTCG-3′。所得CT值按照2-△△ct的方法,進行均一化處理后再進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 CFs的鑒定 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),乳鼠CFs生長迅速,1～2 d即呈融合狀態(tài)。細胞多呈梭形或紡錘形,胞體較大,胞質(zhì)透明,折光性弱,細胞核呈橢圓形,通常含2～3個核仁,無自發(fā)搏動。以波形蛋白蛋白以及α-SMA作為檢測指標,對CFs進行標記和鑒定。結(jié)果顯示,CFs波形蛋白染色呈陽性信號，見圖1a、1b；CFs α-SMA染色呈陰性信號，見圖2a、2b。細胞純度達95%以上。

圖1 CFs波形蛋白免疫組織化學染色(1a.×200，1b.×400)

圖2 α-SMA免疫組織化學染色(2a.×200，2b.×400)

2.2 FZHY對AngⅡ誘導的CFs增殖的影響 各組OD值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，空白對照組與DMSO對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組相比，AngⅡ組CFs OD值明顯升高(P<0.01)；與AngⅡ組相比，25 μg/mL FZHY組、50 μg/mL FZHY組和100 μg/mL FZHY組CFs OD值均降低(P<0.05或P<0.01)，并且呈劑量依賴性。見表1。

組別nOD值空白對照組60.510±0.020DMSO對照組60.519±0.058AngⅡ組60.575±0.024a25 μg/mL FZHY組60.541±0.032b50 μg/mL FZHY組60.529±0.016b100 μg/mL FZHY組60.498±0.026bF值6.351P值<0.001

FZHY：扶正化瘀方；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；DMSO：二甲基亞砜；CFs：心肌成纖維細胞；OD：光密度；a與空白對照組比較,P<0.01；b與AngⅡ組比較，P<0.05或P<0.01

2.3 FZHY對AngⅡ誘導的CFs凋亡的影響 各組早期凋亡率和總凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與空白對照組比較，AngⅡ組CFs早期凋亡率與總凋亡率降低(P<0.01)；與AngⅡ組相比，F(xiàn)ZHY組CFs早期凋亡率與總凋亡率升高(P<0.01)；各組中晚期凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

組別n早期凋亡率中晚期凋亡率總凋亡率空白對照組619.783±3.0826.283±2.15426.067±2.947AngⅡ組613.017±2.277a4.483±1.40517.500±2.673aFZHY組619.175±3.384b5.767±1.667 24.875±2.649bF值9.6771.05516.145P值0.0030.226<0.001

FZHY：扶正化瘀方；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；CFs：心肌成纖維細胞；a與空白對照組比較,P<0.01；b與AngⅡ組比較，P<0.01

3a.空白對照組； 3b.AngⅡ組； 3c.FZHY組； 3d.陰性對照組； AV-FITC：熒光素異硫氰酸酯； PI：碘化丙啶； FZHY：扶正化瘀方； AngⅡ：血管緊張素Ⅱ； CFs：心肌成纖維細胞

圖3 FZHY對AngⅡ誘導的CFs凋亡的影響

2.4 FZHY對AngⅡ誘導的CFs miR-29b-5p表達的影響 空白對照組、AngⅡ組、FZHY組miR-29b-5p的表達分別為(1.017±0.218)、(0.729±0.119)、(1.033±0.235)，各組CFs miR-29b-5p表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4.033，P=0.046)。與空白對照組比較，AngⅡ組CFs miR-29b-5p表達降低(P<0.05)；與AngⅡ組相比，F(xiàn)ZHY組CFs miR-29b-5p表達升高(P<0.05)。

3 討 論

FZHY具有活血化瘀,益氣扶正的功效。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY不僅對肝纖維化療效顯著，還可以不同程度地改善肺及腎的纖維化[7-9]。各臟器纖維化雖然是相對獨立的疾病,但基本病理改變相似,均是由纖維生成細胞活化、致纖維化因子增加、細胞外基質(zhì)合成與降解失衡所致[10]。故藥理學上可以相互借鑒，用FZHY達到異病同治的效果。在此理論指導下，本課題組前期研究證實，F(xiàn)ZHY可抑制心肌膠原表達，改善心功能，具有緩解心肌梗死后心肌纖維化的作用[11]。

正常心肌組織中約2/3的細胞是非心肌細胞，其中CFs占90%以上[12]。CFs是一種具有增殖和多向分化潛能的細胞，在壓力負荷等條件刺激下過度增殖，引起細胞外基質(zhì)蛋白、細胞因子和生長因子等分泌增加，導致心肌纖維化[13]。凋亡是機體清除衰老及異常細胞的過程[14]，CFs的凋亡減少是心肌纖維化的成因之一。纖維化過程中CFs的過度增殖也意味著其凋亡程序的減弱[15]。因此，抑制CFs的異常增殖并促進其凋亡可能是防治心肌纖維化的有效途徑之一。AngⅡ是CFs的重要生長調(diào)節(jié)因子,通過與其表面的AngⅡⅠ型受體結(jié)合，刺激CFs增殖的改變[16]。故本實驗采用AngⅡ刺激CFs建立心肌纖維化細胞模型。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ 可以明顯刺激CFs的增殖，降低CFs的早期凋亡率與總凋亡率；而FZHY可以逆轉(zhuǎn)AngⅡ的促增殖作用并使CFs的早期凋亡率與總凋亡率顯著升高，提示FZHY改善心肌纖維化的作用機制可能與其抑制AngⅡ誘導的CFs增殖并促進CFs凋亡有關。

miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，通過抑制mRNA的翻譯或促進mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達[17]。研究表明，miRNA可通過參與細胞的增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)合成等多個環(huán)節(jié)調(diào)控纖維化進程[18-20]。miR-29主要表達于CFs，是心肌纖維化的調(diào)節(jié)因子之一，其家族成員包括miR-29a、miR-29b(miR-29b1/2)、miR-29c[21]。研究證實，miR-29可直接靶向抑制細胞外基質(zhì)等纖維化相關蛋白的表達而改善心肌纖維化[5]。此外，miR-29b還可作為轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads等致纖維化相關通路的上游因子調(diào)控心肌纖維化的發(fā)展[22-25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)了miR-29抗纖維化過程中存在的Smad3依賴機制。以上結(jié)果均提示miR-29具有抗心肌纖維化的作用。

miR-29b1與miR-29a的基因簇同位于染色體7q32.3，而miR-29b2與miR-29c的基因簇同位于染色體1q32.2[27],因此miR-29b1和miR-29b2可分別與miR-29a和miR-29c共表達。由此推斷，miR-29b可能更具代表性[6]。Zhang等[6]觀察到AngⅡ刺激可使CFs中的miR-29a和miR-29c表達降低，而過表達或抑制miR-29b表達對miR-29a和miR-29c的表達并無明顯影響，提示miR-29b在AngⅡ誘導的心肌纖維化過程中具有特殊地位。本實驗以miR-29b-5p 為研究對象，結(jié)果表明AngⅡ的刺激使CFs的miR-29b-5p表達水平降低，而FZHY促進miR-29b-5p表達升高，提示FZHY改善心肌纖維化的作用機制與其上調(diào)CFs中的miR-29b-5p表達有關。

本研究在細胞水平初步探討了FZHY抗心肌纖維化的分子機制，證實FZHY抗心肌纖維化的作用可能與其抑制AngⅡ誘導的CFs增殖、促進凋亡，提高miR-29b-5p表達有關。然而miR-29b-5p的表達與CFs增殖及凋亡之間的具體關聯(lián)尚不清楚。綜合前期的實驗結(jié)果推測，F(xiàn)ZHY抗心肌纖維化的作用機制可能與miR-29b-5p靶向抑制細胞外基質(zhì)蛋白相關基因或調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads信號通路，從而減少Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積，維持細胞外基質(zhì)代謝平衡有關。本課題組將在在今后的實驗中,采用細胞轉(zhuǎn)染等技術進一步驗證FZHY改善心肌纖維化的分子機制。