高景凱， 趙前程， 孫佳琦， 苗永美

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

植物內(nèi)生菌(Endophytes)是指那些生活史的一定或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌、細(xì)菌或放線菌,可通過組織學(xué)方法或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生[1-2]。內(nèi)生菌分布非常廣泛,內(nèi)生菌與宿主植物在長期的進(jìn)化過程中形成了互惠共生的關(guān)系[3]。基于內(nèi)生菌種類多樣性、代謝途徑的豐富性和能夠獨(dú)立合成和促進(jìn)寄主合成結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物等原因,內(nèi)生菌是生產(chǎn)天然產(chǎn)物的重要來源[4-6]。

石豆蘭為蘭科石豆蘭屬(Bulbophyllum)多年生常綠匍匐小草本植物,全草或假鱗莖皆可入藥[7],具有祛風(fēng)除濕,消腫止痛,涼血活血、抗癌等功效[8-9]。由于環(huán)境污染問題和過度采挖,石豆蘭自然數(shù)量日益減少。因此,大力發(fā)展人工種植石豆蘭,研究其藥用成分及生物價(jià)值成為石豆蘭產(chǎn)業(yè)的一門重要課題。石豆蘭組織組培和細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),石豆蘭內(nèi)生菌豐富,有些菌株能與寄主離體共培養(yǎng),進(jìn)一步證明了內(nèi)生菌在促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)及促進(jìn)幼苗生長等方面起重要作用的觀點(diǎn)[10-11]。

植物內(nèi)生菌豐富,蘊(yùn)含著優(yōu)異基因,是天然產(chǎn)物的重要來源,故研究火熱,并取得重大進(jìn)展。關(guān)于石豆蘭內(nèi)生菌多樣性未見報(bào)道,本研究以福建南屏的廣東石豆蘭(BulbophyllumkwangtungenseSchltr.) 為材料進(jìn)行內(nèi)生菌分離,研究內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值,以期獲得優(yōu)良菌株,為進(jìn)一步豐富和開發(fā)內(nèi)生菌資源提供初步前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

石豆蘭采自福建南屏鴛鴦獼猴自然保護(hù)區(qū),由安徽科技學(xué)院從事植物學(xué)教學(xué)與科研的王玉良副教授鑒定為廣東石豆蘭。病原菌為致棉花枯萎的尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(Fusariumoxysporumf.sp. vasinfectum)和致黃瓜枯萎的尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp cucumerinum),由本校農(nóng)學(xué)院段海明博士提供。

分離培養(yǎng)基共7種:NA培養(yǎng)基(牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母膏1 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 7.0～7.2);金氏培養(yǎng)基(蛋白胨20 g、甘油10 g、瓊脂15 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、蒸餾水1 L、pH 7.2);YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10 g、蛋白陳20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH 7.2);LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、酵母膏5 g、瓊脂15 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 L、pH 7.0);大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、大豆胨5 g、瓊脂15 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 L、pH 7.2～7.4);YG培養(yǎng)基(酵母膏3 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 9.0);R2A培養(yǎng)基(酵母粉0.5 g、胰蛋白胨0.25 g、葡萄糖0.5 g、淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、瓊脂15 g、K2HPO40.3 g、MgSO40.024 g、pH 7.0～7.4)。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃滅菌15 min,備用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化與保存 材料經(jīng)過清洗,稱取葉片、假鱗莖、橫走莖、根4種器官各1 g,分別用75%的酒精處理30 s,無菌水清洗3次,再用0.1%HgCl2消毒8 min,無菌水洗滌5次。取最后一次洗滌水涂平板,培養(yǎng)3 d,確定外植體表面是否消毒徹底。將表面消毒徹底的材料切碎,按1∶20比例加入無菌水研磨成勻漿。4種研磨原液依次稀釋成1×10-1、1×10-2、1×10-3共3個(gè)梯度,渦旋混勻,吸取100 μL涂布于7種分離培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度涂布3個(gè)皿,培養(yǎng)4 d。依據(jù)顏色、大小、形態(tài)等特征統(tǒng)計(jì)數(shù)量和種類,并挑單菌落,劃線純化保存。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定 菌株基因組DNA提取參照苗翠蘋的方法[12],采用16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列如下:

PA:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(對(duì)應(yīng)E·coli的7-24位堿基)

PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(對(duì)應(yīng)E·coli的1 540-1 522位堿基)

PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序參照苗翠蘋的方法[12],擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果使用EzBioCloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)在線比對(duì)工具進(jìn)行序列分析,確定各菌株的有效發(fā)表近緣種。從Genbank中調(diào)取相似性高的近緣種的16S rRNA基因序列,用Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì),通過MEGA 7.0軟件選用Kimura2-parameter距離模型計(jì)算進(jìn)化距離,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,1 000次隨機(jī)抽樣計(jì)算Bootstrap值以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

1.2.3 對(duì)峙抑菌試驗(yàn) 采用菌落對(duì)峙法對(duì)分離到的38株細(xì)菌進(jìn)行抑制棉花枯萎病和黃瓜枯萎病原菌初篩試驗(yàn)。直徑為9 cm的培養(yǎng)皿,制作PDA平板,在直徑線上距皿邊緣2.5 cm處分別接內(nèi)生菌、棉花枯萎病原菌或黃瓜枯萎病原菌,使內(nèi)生細(xì)菌和病原菌形成相距4 cm的對(duì)峙狀態(tài),于28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察病原菌生長狀況,對(duì)照和處理都重復(fù)3次。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物抑菌試驗(yàn) 對(duì)峙抑菌試驗(yàn)篩選到有抑菌效果的內(nèi)生菌,從試管斜面刮取一環(huán)接種到5 mL液體LB中,30 ℃震蕩培養(yǎng)過夜得種子液。按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖瓶裝量25 mL/50 mL,30 ℃,180 r/min培養(yǎng)3 d,10 000 r/min離心20 min,取上清依次經(jīng)過0.45 μm和0.22 μm無菌微孔濾膜過濾得發(fā)酵濾液。6 mL發(fā)酵濾液與54 mL PDA混合均勻倒3個(gè)平板(9 cm)。病原菌經(jīng)過活化長滿平皿后,用直徑0.8 cm的打孔器沿邊緣一圈打菌餅,將菌餅倒扣在平板中央,以不加發(fā)酵液PDA為對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)4 d,十字交叉法測(cè)量菌落直徑,平均值為菌落直徑。計(jì)算抑菌率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。

2 試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

表1 不同器官不同培養(yǎng)基上內(nèi)生菌的株數(shù)

試驗(yàn)結(jié)果表明,0.1%HgCl2消毒8 min能殺死外植體表面微生物,10-3是分離、容易挑取單菌落的最佳稀釋梯度。不同器官不同培養(yǎng)基上分離到的菌株數(shù)不同(表1),從四種器官分離到的菌株數(shù)由多到少順序:假鱗莖>橫走莖>根>葉;8種分離培養(yǎng)基分離得到菌株數(shù)最多的是LB培養(yǎng)基,明顯高于其它七種培養(yǎng)基,說明LB培養(yǎng)基適合絕大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌的生長,因此,后面的試驗(yàn)采用LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。對(duì)分離到的內(nèi)生細(xì)菌在初步形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子學(xué)鑒定,共39種。根據(jù)圖1系統(tǒng)進(jìn)化樹可以將39種菌分為兩大類群。第一大類群為厚壁菌門(Firmicutes),涉及3科4屬,共34種(表2)。有芽孢桿菌科(Bacillaceae)的芽孢桿菌屬(Bacillus,30種,76.92%)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus,1種,2.56%),類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus,2種,5.13%),葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的葡萄球菌屬(Staphylococcus,1種,2.56%);第二大類為γ-變形菌門(γ-Proteobacteria),涉及2科4屬5種,有腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的腸桿菌屬(Enterobacter,2種,5.13%)、勒克菌屬(Leclercia,1種,2.56%)、科薩克氏屬(Kosakonia,1種,2.56%)和假單孢菌科(Pseudomonadaceae)的假單孢菌屬(Pseudomonas,1種,2.56%)。

表2 石豆蘭內(nèi)生細(xì)菌與其相似菌株的分析及抑菌活性

注:Ah和Am是分別表示對(duì)峙法對(duì)黃瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌的抑菌率,Bh和Bm是分別是發(fā)酵液法對(duì)黃瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌的抑菌率,“-”代表無抑菌活性

圖1 石豆蘭內(nèi)生細(xì)菌分離株16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 內(nèi)生細(xì)菌抑菌結(jié)果

對(duì)峙法抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明(表2),39株內(nèi)生細(xì)菌中對(duì)黃瓜枯萎病原菌具有抑制作用的有16株,對(duì)棉花枯萎病原菌具有抑制作用有14株,對(duì)兩種病原菌都有抑制作用的有10株。將初步篩選出具抑菌功能的陽性菌株,用LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵3 d,其無菌濾液經(jīng)PDA稀釋10倍后,接種兩種病原菌。結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)對(duì)黃瓜枯萎病原菌具抑制功能的有13株,抑菌率在3.36%～40.38%之間,其中BK15號(hào)抑菌率最高,對(duì)棉花枯萎病原菌具抑制功能的有13株,抑菌率在5.77%～60.78%之間,BK26號(hào)菌抑菌率最高。編號(hào)BK1、BK3、BK8、BK15、BK19、BK23、BK31共7株菌對(duì)兩種病原菌均有抑制功能。

圖2 對(duì)棉花枯萎病和黃瓜枯萎病菌絲生長抑制效果

圖3 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)棉花枯萎病和黃瓜枯萎病菌絲生長抑制效果

3 結(jié)論與討論

本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定廣東石豆蘭表面消毒方式是用0.1%HgCl2處理8 min,此條件足可以殺死表面微生物。表面消毒方式對(duì)確保分離到的菌是否內(nèi)生至關(guān)重要,消毒方式與材料種類、來源、部位等因素有關(guān),不同植物采取的消毒方式不同[13],因此,分離內(nèi)生菌之前先確定消毒方式,即保證能殺死表面微生物,又不傷害內(nèi)部菌。本研究選用了四種器官進(jìn)行內(nèi)生菌分離,不同器官含細(xì)菌的豐富程度不同,假鱗莖內(nèi)生菌含量最為豐富,在8種培養(yǎng)基上分離到菌最多,橫走莖次之,葉最少;可能是因?yàn)榧禀[莖是石豆蘭的藥食部位,生長周期長,營養(yǎng)豐富,其內(nèi)生環(huán)境適合細(xì)菌生長,而葉片革質(zhì),組織成分較為單一,不太適合內(nèi)生菌的繁殖。而在鐵皮石斛中,根部分離到的內(nèi)生菌數(shù)量多于莖和葉部[14]。

基于不同內(nèi)生菌需要不同的生長環(huán)境,設(shè)計(jì)了8種分離培養(yǎng)基[15-16],四種器官均利用LB培養(yǎng)基分離得到菌株數(shù)最多,菌株數(shù)明顯高于其它七種培養(yǎng)基,說明LB培養(yǎng)基適合廣東石豆蘭絕大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌的生長。本研究結(jié)果表明,從廣東石豆蘭分離到的內(nèi)生細(xì)菌種類并不多,經(jīng)過16S rRNA比對(duì)共有39株內(nèi)生細(xì)菌,可能因?yàn)閺V東石豆蘭內(nèi)生菌材料來源單一,生長條件苛刻,大多數(shù)不可培養(yǎng)。39株菌歸屬厚壁菌門(Firmicutes)和γ-變形菌門(γ-Proteobacteria),植物分離結(jié)果與Galdiano等[17]、俞婕等[18]從蘭科植物種分離的內(nèi)生菌結(jié)果類似,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)最多,占76.92%,這與楊娜等從蘭科植物中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌種群優(yōu)勢(shì)的結(jié)果較為一致[19]。同時(shí)分離出的內(nèi)生細(xì)菌中還有假單胞菌屬,這與嚴(yán)亮等[14]對(duì)云南鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果較為一致。對(duì)篩選到的內(nèi)生菌選用對(duì)峙法初步篩選出抑制黃瓜枯萎病原菌和棉花枯萎病原菌的菌株,用其發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩,對(duì)兩種病菌具抑制作用各有13株,占分離菌株的33.33%,其中7株兼有抑制兩種病菌的作用,說明廣東石豆蘭內(nèi)生菌可作為生防菌用于農(nóng)作物病害的防治。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,廣東石豆蘭體內(nèi)擁有一定豐富度的內(nèi)生細(xì)菌資源,33.33%內(nèi)生菌對(duì)黃瓜枯萎病原菌或棉花枯萎病原菌有抑制作用,17.95%內(nèi)生菌對(duì)兩種病菌都具抑制作用。研究結(jié)論為廣東石豆蘭內(nèi)生菌資源的生物活性物質(zhì)篩選以及開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。