龔菊梅， 劉修樹， 范高福， 劉龍云， 湯 潔， 范雪梅， 王義明

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230038; 2.清華大學(xué) 化學(xué)系，北京 100084)

傳遞體作為一種新型透皮給藥制劑[1]，是在非封閉式給藥的方式下，在角質(zhì)層水合梯度的驅(qū)動下，結(jié)合自身具備的高度變形作用，高效穿透比其自身小數(shù)倍的皮膚孔道，到達(dá)真皮，隨后是更深的組織，再經(jīng)由淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液從而使一些難以透皮的大分子藥物成功進(jìn)入皮膚甚至進(jìn)入體循環(huán)[2]。

本實驗采用高效液相色譜法對胰島素傳遞體體外測定分析方法進(jìn)行研究，HPLC法在用于胰島素體外分析方法的建立上具有優(yōu)勢明顯，具有準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好等特點[3-4]。在方法的選擇上參考脂質(zhì)體的分析方法和質(zhì)量檢查項目，設(shè)計合理的胰島素傳遞體體外分析的方法學(xué)內(nèi)容，主要包括色譜條件的選擇、系統(tǒng)適應(yīng)性和方法專屬性條件的確定、精密度和準(zhǔn)確度的判斷[5]、回收率[6]與包封率[7]方法的選擇和考察等，通過高效液相色譜儀建立合理的胰島素傳遞體體外分析的方法。同時驗證了此方法學(xué)的可行性和準(zhǔn)確性，從而為胰島素傳遞體的處方設(shè)計、理化性質(zhì)、體內(nèi)分析和質(zhì)量控制等后續(xù)研究提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

L-2000高效液相色譜儀(日本日立公司)；XS-105電子天平(梅特勒-托利多公司)；Labway Science Micro 22R型高速冷凍離心機(jī)(北京博威興業(yè)科技發(fā)展有限公司)；TYP-2型藥物透皮擴(kuò)散試驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；PHS-3C pH計(北京博遠(yuǎn)祥德科學(xué)儀器有限公司)。胰島素對照品(sigma公司，批號：20121023)；胰島素原料藥(sigma公司，批號：20130510)；豬膽酸鈉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；葡聚糖凝膠G-50(分析純，北京索萊寶科技有限公司)；三乙醇胺(分析純，天津市博迪化工有限公司)；乙腈(色譜純，色譜純，德國merck公司)；乙醇(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；磷酸二氫鈉(分析純，北京化工廠)；卡波姆(Noveon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱選用Phenomenex Luna C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動相:A 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)，B 乙腈；梯度洗脫如下: 0～6 min,26%～32% B;6～10 min,32% B;10～16 min,32%～38% B;16～22 min,38% B 流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：214 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備 精密稱取胰島素4.00 mg，加0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)定容于10 mL容量瓶中，配制成400 μg/mL的對照品儲備液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對照品溶液的配制 精密量取胰島素對照品儲備液1 mL至5 mL容量瓶中，加0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)溶解并定容，得到濃度為80 μg/mL的胰島素對照品溶液。

1.2.4 供試品溶液配制 吸取胰島素傳遞體適量，置于10 mL容量瓶中，加入一定量乙醇破乳，用0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)稀釋至刻度，搖勻，制得供試品溶液。精密量取空白傳遞體0.5 mL，按上述方法破乳定容后，即得空白供試品溶液。

1.2.5 方法專屬性考察 分別取胰島素對照品溶液、空白傳遞體溶液和胰島素傳遞體供試品溶液各20 μL注入高效液相色譜儀，比較3組色譜圖，考察所用輔料對胰島素的含量測定是否有干擾，并記錄色譜圖。

1.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”節(jié)下對照品儲備液溶液(400 μg/mL)，用0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)配制成400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的對照品溶液，分別過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣，記錄峰面積，并以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取“線性關(guān)系考察”節(jié)下的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積和保留時間，計算RSD值。

1.2.8 精密度實驗 精密量取對照品儲備液適量，用磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)配制200、100、50 μg/mL的高、中、低3 個質(zhì)量濃度的溶液，各3 份，參照“2.1”節(jié)下的色譜條件在1 d內(nèi)進(jìn)樣3次，每次20 μL，記錄峰面積，計算日內(nèi)精密度；每天測定1 次，連續(xù)3 d，記錄峰面積，計算日間精密度。

1.2.9 回收率實驗 分別精密量取400、500、600 μL對照品儲備液(400 μg/mL)至2 mL容量瓶中，分別加500 μL的空白傳遞體，加入500 μL的乙醇破乳后，再用pH 3.0的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，即得濃度分別為80、100、120 μg/mL含空白傳遞體的胰島素溶液。按“2.1”節(jié)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣20 μL，平行3次，記錄峰面積，計算回收率。

1.2.10 包封率及載藥量的測定 取3份胰島素傳遞體樣品，每份各1 mL分別置于1.5 mL的離心管中，于4 ℃，20 000 rpm，30 min條件下離心，取上清液約400 μL，定容至1 mL，經(jīng)HPLC分析，計算傳遞體中未被包封的胰島素質(zhì)量M1；另取胰島素傳遞體溶液400 μL，加入適量乙醇破乳后定容至1 mL，進(jìn)樣分析，計算體系中總胰島素的含量M0，計算3 份樣品中胰島素傳遞體包封率(EE)[9-10]，計算RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察

通過對胰島素對照品溶液、空白傳遞體溶液和胰島素傳遞體供試品溶液的考察，所得色譜圖如圖1所示。

注：A空白傳遞體、B胰島素標(biāo)準(zhǔn)品、C胰島素傳遞體

由圖1可知,胰島素對照品溶液、空白傳遞體溶液和胰島素傳遞體供試品溶液的色譜圖中，胰島素的保留時間均在8.0～9.0 min，主藥峰與輔料峰良好分離，輔料對胰島素測定無干擾，表明此方法專屬性好。因此，此色譜條件可用于胰島素傳遞體中主藥含量的測定。

2.2 線性關(guān)系考察

胰島素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性回歸方程為Y=36 595X-288 707，R2=0.999 6，胰島素在6.25～400 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 胰島素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

圖2 胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

通過胰島素對照品5次重復(fù)進(jìn)樣后記錄的峰面積和保留時間的數(shù)值，計算得到的胰島素峰面積和保留時間的RSD值為1.02%、0.75%，均符合要求，說明該方法下的儀器系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.4 精密度實驗

日內(nèi)和日間精密度結(jié)果見表2，結(jié)果表明該方法精密度符合方法學(xué)要求，可用于含量測定。

表2 胰島素傳遞體日內(nèi)、日間精密度測定(n=3)

2.5 回收率實驗

回收率結(jié)果見表3，結(jié)果表明回收率在98%～105%之間，RSD值<2%，該方法回收率符合方法學(xué)要求，方法的準(zhǔn)確性良好。

表3 胰島素傳遞體加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 包封率及載藥量的測定

測定3批胰島素傳遞體供試品的包封率，3次實驗計算結(jié)果顯示，制得的傳遞體對胰島素的包封率3次測定結(jié)果分別為83.65%、83.53%、83.89%。均值為83.68%，RSD值0.18%。均滿足藥典對脂質(zhì)體包封率的要求(>80%)。

3 結(jié)論與討論

傳遞體作為一種特殊的脂質(zhì)體，具有高度的變形力。以傳遞體作為載體，介導(dǎo)胰島素可制備成經(jīng)皮給藥制劑，通過透皮吸收解決胰島素不能口服，只能注射的缺點，為胰島素新制劑的研究提供一種思路。

本文采用了HPLC法建立胰島素傳遞體體外分析的方法，HPLC法準(zhǔn)確性高[8]，靈敏度強(qiáng)，重現(xiàn)性好，符合樣品分析要求[9]。系統(tǒng)適應(yīng)性和方法專屬性考察中，輔料對主藥無干擾且方法準(zhǔn)確性高[10]；精密度和回收率均符合要求；同時確立了胰島素傳遞體包封率測定的方法：低溫高速離心法。此方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確[11]，測定的胰島素傳遞體包封率符合《中國藥典》要求。

包封率測定方法選擇的關(guān)鍵是游離藥物與傳遞體制劑的分離效果。本實驗中，以包封率為考察指標(biāo)，對葡聚糖凝膠法、超濾離心法和低溫高速離心法3種常見的包封率測定方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，胰島素傳遞體和未包封的游離胰島素在4 ℃，20 000 rpm，30 min的條件下能夠很好分離，通過測定游離胰島素的含量計算出的胰島素傳遞體的包封率，符合藥典對包封率的規(guī)定，最終確定低溫高速離心法作為胰島素傳遞體包封率測定的方法。