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（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性消化道疾病。主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，腹瀉仔豬死亡率高達(dá)100%[1]。PEDV是一種腸嗜性病毒，主要經(jīng)消化道進(jìn)入小腸感染機(jī)體。一旦被PEDV感染，PEDV在感染機(jī)體的腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)大量增殖，被感染的細(xì)胞迅速溶解壞死，導(dǎo)致明顯的小腸絨毛萎縮，吸收表面積減少，小腸黏膜堿性磷酸酶含量顯著減少，進(jìn)而引起營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，導(dǎo)致腹瀉、脫水、死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)PEDV的感染與仔豬日齡緊密相關(guān)，低日齡仔豬的感染和發(fā)病情況更為嚴(yán)重，14日齡以下仔豬感染PEDV后，其死亡率為90%，而14～28日齡仔豬的死亡率會(huì)下降至40%，提高低日齡仔豬對PEDV的抵抗力是保護(hù)仔豬的關(guān)鍵[3-4]。疫苗免疫母豬后，誘導(dǎo)乳汁免疫，隨后通過其初乳和乳汁傳遞至新生仔豬，以實(shí)現(xiàn)對新生仔豬的早期被動(dòng)免疫。低日齡仔豬腸道細(xì)胞再生較慢，或者初生仔豬各免疫系統(tǒng)還不夠完善可能是導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)病率更為嚴(yán)重的原因[5]。而具備相對完善免疫系統(tǒng)的成年豬和育肥豬，病毒感染增殖的同時(shí)，腸內(nèi)的多種免疫細(xì)胞針對各自特定靶細(xì)胞受體作出應(yīng)激反應(yīng)，阻止了豬流行性腹瀉病毒繼續(xù)感染機(jī)體。腸道組織中的局部黏膜免疫系統(tǒng)在對抗PEDV感染的過程中發(fā)揮了重要作用[6-7]。

盡管IgG抗體占初乳免疫球蛋白總量的60%以上，但I(xiàn)gA抗體對于中和腸道感染的病原體比IgG抗體更有效果[8]。母源抗體中的IgG免疫球蛋白被仔豬腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)提供體液免疫，而IgA免疫球蛋白則粘附在腸道上。哺乳仔豬通過吮吸母乳獲得母源抗體SIgA后，SIgA能夠抑制PEDV在腸道上皮細(xì)胞的附著與增殖，保護(hù)仔豬腸道上皮細(xì)胞，阻止PEDV侵入機(jī)體[9]。研究表明，接受母源抗體的仔豬、保育豬糞樣中PEDV的RNA載量明顯減少，母豬乳汁IgA抗體水平高，其所產(chǎn)仔豬糞樣中PEDV的RNA載量相對就低[10]?？讏@園等[11]研究發(fā)現(xiàn)，母豬乳汁中IgA抗體水平高，仔豬發(fā)病率就會(huì)降低，反之發(fā)病率會(huì)增加。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PEDV IgA、IgG抗體間接ELISA方法以及PEDV RT-PCR病原學(xué)檢測方法，對免疫母豬群和疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進(jìn)行相關(guān)抗體水平及PEDV測定，探討IgA、IgG抗體水平與PEDV病原之間的相關(guān)性，以期為我國豬群豬流行性腹瀉免疫效果評估及程序的制定、優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 乳汁采自廣東地區(qū)某豬場疑似仔豬腹瀉母豬群乳汁及免疫過豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗相關(guān)產(chǎn)品的豬群乳汁、血清。

1.2 主要試劑 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit購自金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker 和dNTPs（2.5 mmol/L）購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技 （北京）有限公司；PEDV乳汁IgA、IgG抗體檢測試劑盒為實(shí)驗(yàn)室自建。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中登陸的PEDV ORF3基因序列，通過Primer Permier 5.0和Oligo 7.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列及樣品處理方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.2 PEDV RT-PCR的擴(kuò)增 以處理好的樣品cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的能夠區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的特異性引物對疑似仔豬腹瀉母豬群14份乳汁進(jìn)行常規(guī)的PEDV RT-PCR檢測，確定乳汁中PEDV的感染情況。擴(kuò)增體系20 uL：其中2×Max 10 μL、上下游引物（20 μmol/mL）各 0.4 μL、cDNA 0.4 μL、 補(bǔ)充去離子水至終體積為 20 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 2 min，98℃變性 10 s；58℃退火5 s，72℃延伸5 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測方法的建立采用純化的PEDV抗原包被ELISA微量反應(yīng)板，按照常規(guī)間接ELISA操作方法[13-14]，建立PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測方法。采用PEDV抗體ELISA檢測方法對上述送檢的疑似仔豬腹瀉豬場14份乳汁進(jìn)行IgA抗體水平測定，并對免疫豬群乳汁對應(yīng)的血清樣品進(jìn)行IgA、IgG抗體水平測定，確定乳汁中PEDV IgA抗體與血清中IgA、IgG抗體水平及其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV RT-PCR擴(kuò)增 采用特異性檢測引物對疑似仔豬腹瀉豬群的14份乳汁進(jìn)行常規(guī)PEDV RT-PCR檢測，確定14份乳汁中有6份為PEDV陽性 （確定7號(hào)樣品為PEDV疫苗株，其片段大小為278 bp，其余5份均為PEDV野毒感染，其片段大小為327 bp），且腹瀉豬只中PEDV野毒陽性率為100%（見表 1、圖 1）。

表1 樣品中PEDV抗原檢測結(jié)果

2.2 乳汁IgA抗體水平的測定 采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PEDV IgA抗體檢測方法對送檢的14份乳汁樣品進(jìn)行IgA抗體水平檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14份乳汁中有4份IgA抗體呈現(xiàn)陰性，其中標(biāo)記為腹瀉豬只的IgA抗體陰性率占100%。且在陽性樣品中，當(dāng)乳汁中IgA抗體水平接近臨界值（0.3）時(shí)，乳汁中PEDV基本呈現(xiàn)陽性（見表2）。

圖1 乳汁樣品中PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

表2 乳汁IgA抗體水平測定

2.3 PEDV IgA、IgG抗體水平的測定 采用實(shí)驗(yàn)室自建的PEDV IgA、IgG抗體檢測方法對送檢免疫健康豬群乳汁及其相對應(yīng)的血清樣品進(jìn)行IgA、IgG抗體水平檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA、IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關(guān)（見圖2-圖4），同時(shí)對乳汁和血清中IgA抗體水平進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)血清中IgA抗體遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳汁中的抗體水平（見圖 3）。

圖2 乳汁中IgA、IgG抗體水平測定圖

3 討 論

研究表明，種豬胎盤屏障結(jié)構(gòu)決定了母源抗體不能直接通過胎盤直接傳遞給仔豬，因此，仔豬獲得母源抗體的主要途徑是通過初乳的攝入。初乳中富含IgG抗體，仔豬攝入后迅速進(jìn)入血液循環(huán)形成保護(hù)性抗體，攝入的IgA抗體可以在腸道局部黏膜建立黏膜免疫，共同抵御外界病原微生物的入侵[15]。對疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進(jìn)行PEDV病原學(xué)檢測及IgA抗體檢測發(fā)現(xiàn)，所有腹瀉仔豬對應(yīng)的母豬乳汁中PEDV抗原均呈現(xiàn)陽性，而腹瀉仔豬所吮乳汁中IgA抗體呈陰性，且乳汁中IgA抗體水平趨于臨界值的情況下，乳汁中PEDV亦呈現(xiàn)陽性。說明乳汁中IgA抗體水平可以反映出哺乳仔豬的黏膜免疫情況[16]。此外，乳汁中的IgA抗體只有達(dá)到一定的水平才能對仔豬腸道黏膜具有保護(hù)作用，低水平的IgA抗體很容易受到PEDV的攻擊。通過檢測乳汁中IgA抗體水平的高低，可以直接對疫苗免疫效力進(jìn)行評價(jià)，進(jìn)而分析仔豬的免疫保護(hù)力情況，及時(shí)做好PED的免疫防控工作。

圖3 血清與乳汁中IgA抗體水平測定圖

圖4 血清中IgA、IgG抗體水平測定圖

對免疫豬群乳汁IgA抗體及其對應(yīng)的血清IgA、IgG抗體進(jìn)行相關(guān)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA和IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性，這與先前報(bào)道的結(jié)果一致[17]。研究表明，母豬口服感染PEDV的腸道內(nèi)容物，利用熒光中和試驗(yàn)測定母豬和哺乳仔豬的血清、母豬初乳和乳汁中中和抗體滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEDV感染后3周內(nèi)母豬血清樣品中可檢測到中和抗體，且乳汁中和抗體滴度至少與母豬血清樣品中一樣，而初乳樣品中的抗體滴度均高于血清和血清樣品。表明初乳和乳汁是仔豬中和抗體的來源[18]。對免疫豬群乳汁和血清中IgA、IgG抗體進(jìn)行相關(guān)檢測，結(jié)果提示，通過血清中IgG的抗體水平能夠間接反映出母豬乳汁中IgA的抗體水平情況，解決了早期因乳汁黏度過大、難以采集的問題，大大提高了樣品采集的效率，降低了豬只的應(yīng)激反應(yīng)，及時(shí)、有效地為我國豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。此外，乳汁中的IgA抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清中的IgA，再次佐證PEDV黏膜免疫機(jī)理：PEDV到達(dá)PP結(jié)后，致敏的B細(xì)胞可歸巢至乳腺，在乳腺局部分泌二聚體IgA，以SIgA形式存在于乳汁中。單體IgA可以進(jìn)入血液循環(huán)，SIgA難以進(jìn)入血液，而是錨定在黏膜表面形成保護(hù)層，抵御病原侵入。

由豬流行性腹瀉病毒引起的豬流行性腹瀉在全國范圍內(nèi)暴發(fā)，且該病在臨床中具有一定的隱蔽性，因此，探尋一個(gè)有效的免疫評估標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。為進(jìn)一步探討乳汁中IgA抗體水平與PEDV易感程度的相關(guān)性，本研究對健康場豬群乳汁IgA抗體水平及PEDV抗原進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳汁IgA抗體陽性值接近臨界值時(shí)，PEDV抗原檢測為陰性，而在發(fā)病場豬群乳汁中則可以檢測到PEDV抗原。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在存在PEDV感染的條件下，高水平的IgA抗體能夠有效地抵御PEDV入侵。母源SIgA的水平與仔豬對PEDV感染的抵抗力有關(guān)，而血液中的中和抗體與其對仔豬的保護(hù)作用沒有相關(guān)性[19-20]。因此，如何有效地刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的高水平IgA抗體，是防控豬流行性腹瀉的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

乳汁IgA抗體是有效保護(hù)低日齡仔豬早期免于PEDV感染的關(guān)鍵性抗體，其抗體水平較低的情況下，極易受到PEDV入侵，該抗體水平變化與疫病的進(jìn)程和機(jī)體的抗病毒能力具有一定的相關(guān)性。此外，通過血清中IgG抗體水平的檢測能夠間接反映出疫苗的免疫保護(hù)水平，有效解決了初乳難以采集的問題，能夠及時(shí)有效地為我國豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及其優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。