凌曉娟,黃 震,李紅霞

(1.寶雞市中心醫(yī)院 產科,陜西 寶雞721008;2.寶雞市中心醫(yī)院 綜合內科,陜西 寶雞721008;3.延安大學附屬醫(yī)院 婦科,陜西 延安716000)

肥胖對個人乃至全球健康影響巨大，孕婦肥胖的發(fā)病率逐年上升，在西方發(fā)達國家，高達17%的孕婦伴有肥胖癥[1]。近年來，孕婦肥胖與妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)的發(fā)病率同時上升，在美國與歐洲GDM的發(fā)病率分別為14%與2%-6%[2]。孕婦體重指數(body mass index,BMI)和GDM會對臨床結局產生較大影響，包括流產和死胎，增加先兆子癇、子宮內生長受限及巨大兒的風險，對胎兒和新生兒的生存造成影響[3]。妊娠期體重增加(gestational weight gain,GWG)、BMI升高及GDM與懷孕期間不健康飲食直接相關[4]。胎盤養(yǎng)分轉運是將母體營養(yǎng)狀況與胎兒生長聯系起來的一種機制，主要通過子宮胎盤血液流動，激素及營養(yǎng)轉運來實現。GDM葡萄糖和脂質運輸增加也伴隨著因滋養(yǎng)層浸潤和血管損害造成的胎盤缺陷[5]。雖然孕前高BMI和胎兒過度生長與Ⅰ型糖尿病顯著相關，但是孕前高BMI且無GDM對于胎盤功能的影響，與GWG和飲食的關系仍未知[6]。孕婦肥胖與代謝有關，血清內激素水平發(fā)生變化，如胎盤瘦素，胰島素和IGF1以及炎性標志物(如白細胞介素-6)的積累[7]。胰島素信號傳導對于血糖濃度的調節(jié)至關重要。研究證實，通過胰島素結合位點數量的改變可以反映GDM和GWG中胎盤胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)水平[8]。雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)是胎兒葡萄糖、氨基酸、胎盤胰島素/ IGF1信號傳導的上游調節(jié)因子，是養(yǎng)分傳導的關鍵，可通過磷酸化機制對GDM和GWG起一定的調節(jié)作用[9]。本研究旨在探討孕婦體重及GDM是否會對胎盤及妊娠結局造成影響，從而實現針對性的干預措施，以防止不良臨床結局的出現。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月-2017年4月于我院進行檢查的孕婦共328例進行回顧性分析，依據孕期BMI進行分組，正常體重組(N,18.5≤BMI<25,n=132)，超重組(OW,18.5≤BMI<25,n=53)，肥胖組(O,BMI≥30，n=64)，此外79名孕經口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)確診為GDM。具體分組情況見圖1。

圖1 參與研究的孕婦分組

1.2 研究方法

孕期，分別于24孕周或34孕周(GDM)開始進行醫(yī)療訪視，胎齡計算始于最后一次月經周期，并且與超聲掃描結果核對，孕齡<37周視為早產。通過第34周的超聲掃描結果來進行胎兒的人體學測量。GWG的診斷標準依據美國醫(yī)學研究院(IOM) 2009年推薦的單胎妊娠婦女(單胎孕婦)孕期增重范圍[10]。根據Lubchenco生長曲線確定胎兒的體型(大型，LGA；小型，SGA)[11]。

1.2.1孕婦營養(yǎng)攝入 收集孕晚期(34-40周)第二次訪視7天內膳食紀錄。對每個孕婦進行口頭和書面說明，分發(fā)小冊子記錄攝入的食物和飲料。分娩時將記錄交于營養(yǎng)師進行分析，采用營養(yǎng)分析CESNID1.0進行營養(yǎng)攝入分析。

1.2.2血液采集與分析 分別于第24孕周、24孕周及分娩時收集孕產婦的靜脈血，于分娩30 min內收集臍靜脈血，用于血液學及生物化學分析。使用血液分析儀(Sysmec XE-2100，羅氏，美國)和流式細胞儀(Advia 120-160 858，Bayer HealthCare，Tarrytown，美國紐約)分析血液學參數。酶促法測量血清中葡萄糖和甘油三酸酯含量(Modular Analytics EVO，Roche，Neuilly sur Seine Cedex，法國)，而血清中胎盤瘦素的測定則采用ELISA法(Biosource Kap2281，丹麥)。

1.2.3胎盤樣本收集 分娩后收集胎盤并立即稱重，由經驗豐富的臨床醫(yī)師對胎盤的壞死或其他異?，F象進行目視檢查，包括胎盤尺寸、重量及形態(tài)學測量，若有多個小葉、胎盤麻疹、環(huán)狀、膜質，梗塞、絨毛膜缺失或血管病變等異常，則從正常區(qū)域取樣。取出子宮內膜后，切下0.5×0.5×0.5 cm(200 mg)的樣品，用生理鹽水清洗兩次，并立即放入含有RNAlater溶液(Qiagen Ltd.，Crawley，英國)無菌離心管中，于-80℃儲存。

1.3 評價指標

1.3.1基因表達 使用200 μl氯仿/1 ml TRI試劑溶液(Sigma Chemical Co.Poole，UK)和RNeasy提取試劑盒(Qiagen Ltd.，英國)，從100 mg胎盤組織中提取總RNA。2 μg RNA使用高容量逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems,美國)，轉錄生成20 μl cDNA。

Real-time PCR 使用15 μl按1∶10稀釋后 cDNA、3.0 μl(終濃度為250 nM)基因特異性引物(表1)和7.5 μl SYBR Green mastermix(Thermo Scientific，ABgene Ltd.英國)。使用Techne Quantica Thermocycler(Techne Inc.，Barloword Scientific，Stone，UK)在96孔板中，使用陰性對照進行重復樣品40個循環(huán)。通過半定量2-ΔCt法計算mRNA表達[12]。

1.3.2胎盤甘油三酯和硫代巴比妥活性物質(thiobarbituric active reactive substance,TBARS)含量 使用Folch法測量甘油三酯含量[13]，TBARS測量依據潘東峰等[14]的研究。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究所以數據均采用SPSS20.0進行統(tǒng)計學處理，計量數據以均數±標準表示，兩組間比較采用Studentt檢驗，多組間比較采用方差分析，當存在統(tǒng)計學差異時應用SNK法進行兩兩比較。應用χ2檢驗或精確概率法比較分類資料組間差異；當需要兩兩比較時，采用Bonferroni法對α進行校正，校正后α水平為0.05/n(n為兩兩比較次數)。

2 結果

2.1 孕婦臨床特征，妊娠結局，胎盤組成和代謝狀態(tài)

GDMO組年齡較大，且失業(yè)比率較高，教育程度普遍較低。OW組與O組具有較大的機率發(fā)生新生兒體重較大，且OW組與O組剖宮產的風險較高(表1)。GDM兩組體重低于N組，反映了他們總能量和碳水化合物攝入較低，且脂質的攝入量也較低(表2)。盡管GDMO組于34周胎齡胎兒體重預估體重較高，但出生時與其他組無顯著差異(表3)。O組胎盤重量較高，且LGA百分比較高。臨近分娩，GDM兩組血糖升高，而O組的單核細胞計數最高。O組胎盤瘦素水平較高。GDMO組胎盤中甘油三酯含量較高，組間TBARS無差異(表4)。

表1 各組一般臨床特征對比

*注：兩兩比較結果1.年齡 GDMN & GDMO> N & OW &O；2.失業(yè)率： GDMO> OW & GDMN &N 且 O>GDMN其他各組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異；3高學歷比例：N>O>GDMO 其他各組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異；4孕期吸煙率：OW> O & GDMN &GDMO 且 N>GDMN,其他各組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異；5平均身高：GDMN & GDMO< N & OW &O；6孕前BMI：GDMO>O>OW>GDMN>N；7 34孕周BMI：O & GDMO>OW>N &GDMN；8 GWG：N & OW> O & GDMN & GDMO；9剖宮產率：OW & O & GDMO>N且O & GDMO>GDMN其他各組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異；；10 早產率：GDMO>OW & N且 O組高于N組其他個組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異；11初產率：N & GDMN & GDMO>OW組，其他各組別兩兩比較未見統(tǒng)計學差異。

表2 孕婦能量及營養(yǎng)攝入

表3 新生兒及胎盤特征

*注：兩兩比較結果 ①胎盤重量：O>N，OW、GDMN及GDMO三個組別分別與任意其他組比較均無統(tǒng)計學差異；②胎盤/新生兒體重：O>GDMO & GDMN & N且OW>N，其他所有組別兩兩比較均無統(tǒng)計學差異。③SGA GDMO>GDMN，其他各組別兩兩比較未見統(tǒng)計學差異。④AGA N & OW>O且 N>GDMO，其他所有組別兩兩比較均無統(tǒng)計學差異。⑤IGA O> GDMN & OW & N，且GDMO>N，其他所有組別兩兩比較均未見統(tǒng)計學差異。

表4 孕婦，胎盤和臍血代謝特征

2.2 孕婦體重，GDM和胎盤標志物，細胞生長和內分泌敏感性

O組mTor的表達減少，但是mTOR的上游(AKT1)和下游(p70S6KB1)靶基因的表達不受影響。GDMO組p70S6KB1表達水平上升。此外，GDM兩組的AMPK基因表達均下降。GDMN組LEP基因表達水平增加，GDMO組LEP基因表達水平則下降。OW組與O組的SIRT1和UCP2基因表達水平均上調。沒有任何證據顯示胎兒年齡、分娩方式或胰島素給藥會對以上結果造成影響(表5)。

表5 孕婦BMI及GDM對胎盤標志物、生長及內分泌的影響

3 討論

本研究中，胎盤組織中ISR1和IGFR1基因的表達與孕婦的BMI及GDM無顯著相關，此結果與Jansson等[15]的研究結果相左，其對瑞曲孕婦進行了研究，其結果顯示胎盤中mTOR的表達水平與胰島素/IGF1及孕婦的BMI指數存在顯著關聯。推測造成結局差異的原因為，北歐女性的平均BMI及GWG均遠高于中國女性[16]。本研究還發(fā)現胎盤組織中mTOR的表達與SIRT1和UCP2表達水平上調有關，說明機體的抗氧化能力上升，符合線粒體中ATP與AMP濃度的調節(jié)機制[17]。這可能是由于AMPK，Akt和mTOR與能量消耗的活動有關[18]。線粒體還通過解耦能量供應來調節(jié)ROS，產生氧化應激，AMPK和mTOR通過UCP2和NFkB的變化對氧化應激進行調節(jié)，從而促進滋養(yǎng)層內的促炎和促氧化途徑[19]。相比之下，線粒體的復制與SIRT1的活性關聯顯著，同時其亦可抑制mTOR活性對細胞周期進行調節(jié)[20]。因此，可得出胎盤的抗氧化應激反應與孕婦的BMI存在一定關聯，這些反應涉及炎癥反應及相關基因的表達[21]。

雖然本研究中，不同組間的甘油三酯濃度差異無統(tǒng)計意義，但GDM肥胖在一定程度上會導致甘油三酯的積累。研究顯示，孕婦的BMI與新生兒LGA存在正相關[22]。伴隨著GDM肥胖孕婦胎盤中甘油三酯的積累，其胎盤中GRa表達水平上調，在胎盤生長的營養(yǎng)調控的模型已經顯示出遵循妊娠胎盤質量變化[23]。

如預期的那樣，孕婦肥胖與血清瘦素較高有關，但其相關代謝機制還未確定[24]。胎盤是血清中瘦素的來源，可被肥胖及GDM刺激，但本研究并未觀察到瘦素基因存在差異性表達。推測其原因為，瘦素的表達存在在周期性變化，同時瘦素可能通過抵制AMPK的表達從而調控胎盤內瘦素的表達[25]。研究顯示，胎盤中瘦素的表達亦會受到糖皮質激素的作用，這與本研究中胎盤中GRa表達水平上調結果相一致，表明GDM肥胖孕婦其胎盤內可能存在局部炎癥反應[26]。

O組、GDMN組及GDMO組的臍帶血中發(fā)現胎盤瘦素水平存在高表達。可能經胎兒胰島素的刺激母體血漿葡萄糖供應增加，從而促進胎兒脂肪沉積[27]。增強的葡萄糖-胰島素途徑與新生兒體重顯著相磁)，而脂肪分子經瘦素通過以葡萄糖依賴性方式誘導IRS1 / MAPK途徑刺激細胞增殖[28]。肥胖孕婦瘦素的循環(huán)與臍血瘦素濃度和單核細胞數量有關[29]。研究顯示，胎盤瘦素除了新生兒體重相關外，還與新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)展存在關聯，對其免疫反應造成影響[30]。研究顯示，在肥胖孕婦中促炎細胞因子(包括TNFa和IL6)的高表達或循環(huán)單核細胞趨化蛋白(MCP1)濃度升高，均有可能導致其嬰兒臍血中單核細胞數量上升[31]。 MCP1的高表達與新生兒脂肪的積累顯著相磁，并最終影響促炎因子及胰島素抵抗水平[32]。由于肥胖及GDM孕婦其胎兒為LGA的風險相對較大，因此進行合理的飲食干預，避免以上臨床結局的發(fā)生。

綜上所述，胎盤中基因的表達對孕婦BMI及GDM的反應較為敏感，BMI及GDM都會影響胎盤甘油三酯含量及養(yǎng)分傳導。因此，可對孕婦及胎兒的葡萄糖平衡進行調節(jié)，控制新生兒體重，以防止不良臨床結局的出現。