張曉恬,王醫(yī)術(shù),林佳慧,楊 格,李美華*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130041;2.吉林大學(xué) 病理生物學(xué)教育部重點實驗室,吉林 長春130021)

化學(xué)治療(chemotherapy)仍然是當(dāng)前抗腫瘤臨床治療的重要方式之一。紅景天作為一種廣泛分布于我國境內(nèi)的天然中草藥植物，其根內(nèi)可提取出多種具備廣泛藥理作用的有效成分，目前認(rèn)為紅景天具備抗炎、抗活性氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫水平等多種作用，紅景天甙作為提取物中關(guān)鍵的活性成分之一，研究、運用較為廣泛[1,2]。已有研究表明紅景天苷能夠通過下調(diào)Bcl-2的表達水平誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡，也可以通過增加脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和IL-2值來明顯抑制人胃癌細(xì)胞系BGC-823的生長[3,4]。但查新結(jié)果表明：當(dāng)前國內(nèi)鮮有關(guān)于紅景天抗唾液腺腫瘤的相關(guān)系列研究。

唾液腺腺樣囊性癌(saliva adenoid cystic carcinoma SACC)作為唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于腮腺及腭部小腺體。腺樣囊性癌具有較強的浸潤性，且好沿神經(jīng)生長，或累及血管引發(fā)血行性轉(zhuǎn)移，遠端轉(zhuǎn)移率在口腔頜面部惡性腫瘤中居首位[5]。如何利用紅景天甙的抗腫瘤作用，為唾液腺腺樣囊性癌的抗腫瘤序列治療提供新的藥物選擇，是口腔頜面外科抗腫瘤化療的研究熱點之一。

本研究擬利用荷瘤裸鼠動物模型探究紅景天甙藥物治療對SACC-2細(xì)胞的影響，為臨床開發(fā)安全有效的抗SACC紅景天中藥制劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

雄性裸鼠20只，18-20 g左右，隨機分配為4組，每組5只，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗材料

人唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞SACC-2 (SIBCB，上海) ，紅景天甙 (吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春)，HE染色液(The Key Laboratory of Pathology and Biology,Ministry of Education，長春)，數(shù)碼顯微照相裝置(The Key Laboratory of Pathology and Biology,Ministry of Education，長春)。

1.3 紅景天甙的提取

取實驗室培植的紅景天根，洗凈，切段；烘干；研磨粉碎；加入重蒸水，置入微波爐中微波；60℃超聲提?。恢卣羲ㄈ?；抽濾，檢測備用。

1.4 動物模型建立

裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，于裸鼠右側(cè)腹股溝處行皮下注射SACC-2細(xì)胞，注射細(xì)胞量為3×106/只。種瘤第2天對4組裸鼠進行不同的治療處理：第一組為紅景天甙處理組，通過腹腔注射紅景天甙溶液對裸鼠進行治療，紅景天甙濃度為20 mg/kg；第二組為5-Fu處理組，通過腹腔注射5-Fu溶液對小鼠進行治療，5-Fu濃度為15 mg/kg；第三組為聯(lián)合用藥組，通過腹腔注射紅景天甙和5-Fu對小鼠進行治療，紅景天甙濃度為20 mg/kg，5-Fu濃度為15 mg/kg；第四組為生理鹽水(Normal Saline，NS)處理組，使用NS通過腹腔注射的方式對小鼠進行治療。治療時間自種瘤第2日開始，治療為每2天一次，共進行5次治療。

1.5 標(biāo)本處理

按時處死裸鼠，取其皮下腫瘤組織，PBS清洗，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的組織塊備用；組織塊置入中性福爾馬林固定液(10%)，完成后石蠟包埋、切片；將厚3-5 μm的切片貼附于經(jīng)P-L-L附膜的載玻片上，65℃烘烤4.5 h，備用。

1.6 HE染色

(1)切片脫蠟至水洗；(2)蘇木精染色5 min，自來水洗；(3)鹽酸酒精分化，自來水洗；(4)弱氨水反藍，自來水洗；(5)伊紅染色15 min，自來水洗；(6)系列ET及Xyl脫水透明，中性樹膠封片；(7)顯微鏡觀察、拍照。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

(1)切片脫蠟至水洗；(2)抗原修復(fù)，置入0.01M(pH 6.0)CPBS于電磁爐上熱修復(fù)5 min；(3)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(4)滴加3%的H2O2(Endogenous Peroxidase Blocking Solution)，室溫孵育15 min;(5)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(6)滴加二抗同種動物非免疫血清封閉，室溫15 min；(7)免洗，去血清，分別滴入制備好的一抗4℃過夜；(8)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(9)滴加生物素化二抗，室溫15 min；(10)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(11)滴加HRP-Avidin，室溫15 min；(12)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(13)新鮮配制的DAB、AEC溶液顯色3-10 min；(14)清水蕩洗，蘇木精淡染胞核，分化。清水蕩洗，返藍，系列ET及Xyl脫水透明，中性樹膠封片；(15)顯微鏡觀察、拍照。

1.8 細(xì)胞增殖指數(shù)計算

Ki67陽性染色主要分布于細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色。隨機選取3個不同的區(qū)域，每個區(qū)域隨機計數(shù)50個細(xì)胞，計算陽性率(增殖指數(shù) PI%=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，增殖指數(shù)的比較用χ2檢驗統(tǒng)計，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對腫瘤形態(tài)的影響

HE染色顯示含瘤組織細(xì)內(nèi)胞形態(tài)的改變情況。結(jié)果顯示，NS組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核異型性大，核染色較深，紅景天甙組、5-Fu組和聯(lián)合用藥組腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核異型性較小，核染色相對淺，其中聯(lián)合用藥組核染色最淺，細(xì)胞核異型性最小(圖1)。

2.2 藥物對SACC-2細(xì)胞增殖的影響

免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色檢驗?zāi)繕?biāo)組織內(nèi)Ki-67的表達情況。結(jié)果顯示，NS組Ki-67陽性表達細(xì)胞多，陽性率高，聯(lián)合用藥組表達細(xì)胞最少，陽性率低，紅景天甙組Ki-67表達的陽性率低于聯(lián)合用藥組(圖2)。

A：NS組 B：5-FU組 C：聯(lián)合用藥組 D：紅景天甙組

A：NS組 B：5-FU組 C：聯(lián)合用藥組 D：紅景天甙

2.3 藥物對SACC-2細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

對免疫組化結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算增殖指數(shù)。結(jié)果顯示生理鹽水組增殖指數(shù)最高，5-FU組及紅景天甙組增殖指數(shù)顯著降低(P<0.01)，二者聯(lián)合應(yīng)用增殖指數(shù)最低(表1)。

表1 各組細(xì)胞的增殖指數(shù)

各組間比較P<0.05

3 討論

健康組織與其來源的腫瘤組織在組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)上存在的差異程度稱為異型性(atypia)，這種差異是臨床病理組織學(xué)中良、惡性腫瘤的重要診斷依據(jù)，也可用腫瘤組織的分化程度來表示。低異型性意味著腫瘤組織具有較高得分化水平，臨床預(yù)后也相對良好。因此，在有藥物治療干預(yù)的情況下，可以通過觀察腫瘤組織細(xì)胞異型性的改變來反應(yīng)藥物對腫瘤的治療作用。Ki-67是與細(xì)胞增殖存在相關(guān)性的一種核抗原，由德國Kiel市的學(xué)者發(fā)現(xiàn)而得名，其表達基因位于人的10號染色體,Ki-67免疫組織化學(xué)染色可以標(biāo)記除細(xì)胞增殖周期中G0期以外的所有時期的細(xì)胞，因而也成為細(xì)胞的增殖指數(shù)[6,7]。同時由于其較短的半衰期，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性，因此已廣泛運用于包括腺樣囊性癌在內(nèi)的多種腫瘤增殖活性檢測[8-10]。

在本研究中，利用HE染色觀察不同藥物處理組的組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的改變，免疫組織化學(xué)染色檢測紅景天甙處理對SACC-2細(xì)胞增殖的影響和對SACC-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Ki-67表達水平的影響，進而反應(yīng)紅景天甙作用于SACC-2細(xì)胞時的藥理作用。HE結(jié)果顯示，HS組腫瘤細(xì)胞內(nèi)胞核異型性大，核染色較深，紅景天甙組、5-Fu組和聯(lián)合用藥組腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核異型性及胞核染色程度均低于生理鹽水組，表明紅景天甙對裸鼠體內(nèi)的SACC-2細(xì)胞具有抑制作用，能夠降低其惡性程度，改善預(yù)后。免疫組化染色結(jié)果則顯示NS組Ki-67陽性表達細(xì)胞多，陽性率高，而聯(lián)合用藥組表達細(xì)胞最少，陽性率低。進一步證實了紅景天甙對SACC-2具有抑制作用，且這種調(diào)控是通過抑制增殖作用完成的。此外，HE染色顯示聯(lián)合用藥組細(xì)胞核異型與胞核染色程度低于紅景天甙組，IHC染色檢測則表明紅景天甙組陽性率低于聯(lián)合用藥組，考慮這種差異的出現(xiàn)可能為聯(lián)合用藥時5-Fu會降低紅景天甙對SACC-2細(xì)胞Ki-67表達水平的抑制作用，其具體機制仍有待進一步研究。

本研究通過建立荷瘤裸鼠動物模型，進一步證實了紅景天甙對SACC-2細(xì)胞具有抑制作用，且這調(diào)控是通過抑制增殖作用完成的，為臨床研發(fā)用于抗唾液腺腺樣囊性癌治療的紅景天中藥制劑提供相應(yīng)的理論依據(jù)。