張淑娟 唐亞萍 梁景耀 劉玉梅

廣州市皮膚病防治所皮膚科 510095

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的累及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病[1]。早期研究認(rèn)為，淋巴細(xì)胞異常是SLE發(fā)病的主要機(jī)制，近年固有免疫包括巨噬細(xì)胞的功能異常被逐漸重視[2]。SLE患者巨噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞的能力下降，具有免疫原性的凋亡碎片大量累積，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)[3]。Ren 等[4]發(fā)現(xiàn)，SLE 患者血清可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡，并下調(diào)正常巨噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞的能力。Lee等[5]在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，SLE血清主要通過血液循環(huán)中外泌體起促炎癥免疫反應(yīng)的作用。姜黃素（curcumin）是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，為多酚類化合物，國內(nèi)外研究表明其具有較強(qiáng)的抗腫瘤[6]及抗炎[7]作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過上調(diào)巨噬細(xì)胞CD14表達(dá)，從而增強(qiáng)其吞噬功能[8]。本研究探討姜黃素能否逆轉(zhuǎn)SLE 患者外泌體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬功能受損，為SLE的治療提供新的線索。

對象與方法

一、研究對象

收集2016年2月至2017年11月廣州市皮膚病防治所和中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院診治的活動(dòng)期SLE 患者18 例，年齡（28.4 ± 5.5）歲，病程中位數(shù)為23（P25，P75：3.75，35.0）個(gè)月，均為女性。診斷符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（ACR）修訂的SLE 分類標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫性疾病。SLE疾病活動(dòng)度評分（SLEDAI）平均為11分，均≥5分。選取18例體檢健康者作為健康對照。兩組受試者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)廣州市皮膚病防治所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（201501），所有患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株（THP-1，ATCC?TIB-202?）、RPMI 1640、胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司）、血清外泌體分離液（美國Life Technologies 公司）、佛波酯（PMA）（P8139，美國Sigma-Aldrich 公司）、兔抗人 CD14 單克隆抗體（ab183322，美國abcam 公司）、兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多克隆抗體（#2146，美國CST 公司）、鼠抗人CD63單克隆抗體（NBP2-42225，美國Novus公司）、鼠抗人 CD81 單克隆抗體（ab79559，美國abcam 公司）、姜黃素（sc-200509，分子量368.38，美國 Santa Cruz 公 司 ）。 pHrodo ? Red 指 示 劑（P35361，美國Life Technologies 公司）用于評估巨噬細(xì)胞吞噬功能。

三、方法

抽取受試者外周靜脈血8 ml置于干燥管，靜置30 min，1 500×g離心15 min分離血清，分裝為600 μl一管，凍存于-80 ℃冰箱用于提取外泌體。

1.血清外泌體提取及鑒定：受試者血清外泌體提取及鑒定方法參考文獻(xiàn)[9]。將18 例SLE 患者的外泌體（SLE-exo）每6例一組隨機(jī)混合分為3組，18 例健康對照者外泌體（CON-exo）同樣分為3 組。采用透射電鏡觀察提取的外泌體。CD63 與CD81為外泌體特異標(biāo)記物，取25 μl外泌體采用Western印跡法檢測CD63、CD81水平。

2.巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)、刺激及吞噬功能測定：使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞，加入160 nmol/L PMA 刺激48 h 誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。更換為含0.5%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，分為 4 組（SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素組、CON-exo 組、CON-exo + 姜黃素組），分別以 SLE-exo 25 μl/ml、SLE-exo 25 μl/ml+ 姜黃素20 μmol/L、CON-exo25μl/ml、CON-exo25μl/ml+姜黃素20μmol/L刺激巨噬細(xì)胞24 h，檢測刺激后巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

巨噬細(xì)胞吞噬功能測定：pHrodo?Red 在中性環(huán)境不發(fā)熒光，被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入囊泡后pH下降，pHrodo?Red發(fā)出紅色熒光。因此，本文使用pHrodo?Red陽性細(xì)胞比例反映具有吞噬功能的巨噬細(xì)胞比例；使用細(xì)胞平均紅色熒光強(qiáng)度反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能。巨噬細(xì)胞吞噬功能越強(qiáng)，pHrodo?Red 陽性細(xì)胞比例越高以及平均熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。按照說明書，將pHrodo?Red 與巨噬細(xì)胞共孵育2 h，采用流式細(xì)胞儀測量熒光強(qiáng)度；采用免疫熒光染色檢測pHrodo?Red 陽性細(xì)胞比例，pHrodo?Red陽性細(xì)胞比例=（紅色熒光細(xì)胞數(shù)/DAPI 染色細(xì)胞數(shù)）×100%，每個(gè)樣本隨機(jī)取200 倍視野5 個(gè)并計(jì)算平均值。

3.刺激后巨噬細(xì)胞CD14水平：分為5組，CON-exo 組、SLE-exo 組、SLE-exo+ 姜黃素1 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素 5 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組，刺激后的細(xì)胞使用蛋白提取裂解緩沖液（RIPA）+ 蛋白酶抑制劑（PMSF；1 mmol/L）提取蛋白，SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)膜后，以GAPDH 為內(nèi)參，檢測CD14蛋白水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、SLE患者血清外泌體及CD63、CD81的表達(dá)

分離純化血清外泌體，電鏡下見直徑約100 nm茶托樣囊泡結(jié)構(gòu)，符合外泌體形態(tài)（圖1）。Western印跡結(jié)果示，SLE組及健康對照組血清外泌體均表達(dá) CD63 及 CD81，SLE 組 CD63 水平高于健康對照組（t=3.26，P=0.03），CD81 水平亦高于健康對照組（t=3.82，P=0.02）。見圖2。

二、姜黃素對SLE患者外泌體刺激后巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

將pHrodo?Red 與巨噬細(xì)胞共孵育后，流式細(xì)胞儀檢測 CON-exo 組、CON-exo + 姜黃素組、SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素組相對熒光強(qiáng)度分別為101.3% ± 14.05% 、94.27% ± 14.13% 、41.02% ±9.54%、87.33% ± 15.01%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.81，P＜ 0.01），SLE-exo 組低于 CON-exo 組（t=5.26，P= 0.001）和SLE-exo + 姜黃素組（t= 3.97，P=0.004）（圖3），CON-exo 組與CON-exo+ 姜黃素組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.61，P=0.570）。

圖1 分離純化的血清外泌體在透視電鏡下表現(xiàn)為直徑約100 nm茶托樣囊泡

圖2 Western 印跡法檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）組與健康對照組血清外泌體CD63及CD81的水平 2A：Western印跡法檢測外泌體中CD63、CD81 電泳圖。18 例SLE 患者及18 例健康對照者的外泌體均每6例一組混合，各分為3組，1 ～3：分別為SLE 1 ～3組；4 ～ 6：分別為健康對照1 ～ 3 組；2B：外泌體CD63、CD81 表達(dá)水平。a：與健康對照組相比，P ＜0.05

免疫熒光染色檢測CON-exo 組、CON-exo+姜黃素組、SLE-exo組、SLE-exo+姜黃素組pHrodo?Red陽性細(xì)胞比例分別為82.16% ± 5.20%、81.33% ±4.51%、54.20% ±9.31%、71.23% ±5.43%，4 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.42，P＜ 0.01），SLE-exo 組低于CON-exo 組（t=5.35，P=0.001）和SLE-exo+ 姜黃素組（t=3.26，P=0.011）。見圖4。

三、姜黃素對SLE患者外泌體刺激后巨噬細(xì)胞CD14蛋白水平的影響

圖3 健康對照組外泌體（Con-exo）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外泌體（SLE-exo）、Con-exo+姜黃素、SLE-exo+姜黃素刺激巨噬細(xì)胞后與pHrodo?Red染色劑共孵育，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度

圖4 免疫熒光染色檢測健康對照組外泌體（Con-exo）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者（SLE-exo）外泌體、Con-exo+姜黃素、SLE-exo+姜黃素刺激巨噬細(xì)胞后pHrodo?Red陽性細(xì)胞比例 DAPI染細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光，吞噬pHrodo?Red的巨噬細(xì)胞呈紅色熒光

CON-exo 組、SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素1 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素 5 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組分別刺激巨噬細(xì)胞后，CD14 蛋白水平分別為96.33%±13.65%、30.67%±5.86%、45.24%±8.89%、72.81%±6.62%、90.67%±12.66%，5 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 24.57，P＜0.01），SLE-exo 組低于 Con-exo 組（t= 8.06，P＜0.001）、SLE-exo+ 姜黃素5 μmol/L 組（t=5.08，P＜0.001）和SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組（t= 7.38，P＜ 0.001），隨著姜黃素濃度增加，CD14 水平有升高的趨勢。見圖5。

討 論

單核/巨噬細(xì)胞的功能受損在SLE 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可以表現(xiàn)為單核/巨噬細(xì)胞IL-1β分泌下降，CD80、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）表達(dá)下降等，而吞噬功能的下降是其經(jīng)典表現(xiàn)之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外泌體能明顯抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能并下調(diào)巨噬細(xì)胞CD14 表達(dá)，而姜黃素可逆轉(zhuǎn)SLE 患者外泌體的作用。外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑約為30 ～120 nm 的小囊泡，廣泛存在于多種體液包括血液中。RNA 及蛋白可被包裹于外泌體中，避免被降解。血清中外泌體能有效地發(fā)揮細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的作用，外泌體上整合素、細(xì)胞間黏附分子1 和MHCⅡ等分子可能參與外泌體的靶向選擇[11]。研究發(fā)現(xiàn)，SLE血清外泌體可使外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥因子（包括α 干擾素、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6）分泌增多，而去除外泌體后的血清無上述作用，血清外泌體的水平與SLE 患者的疾病活動(dòng)呈正相關(guān)[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期SLE患者組外泌體數(shù)量多于健康對照組，并且SLE血清外泌體可能通過抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能，參與SLE的發(fā)病。

近期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素亦能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，對多發(fā)性硬化、炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫異常相關(guān)的疾病有治療作用[12]，但目前缺乏SLE的相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)SLE 患者血清外泌體對巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制作用。另外，有研究稱，CD14是巨噬細(xì)胞吞噬并清除凋亡細(xì)胞的關(guān)鍵分子[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，SLE 外泌體可下調(diào)巨噬細(xì)胞CD14 的表達(dá)，且該作用可被姜黃素逆轉(zhuǎn)。

圖5 健康對照組外泌體（Con-exo）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者（SLE-exo）外泌體、SLE患者組外泌體與1、5、20 μmol/L姜黃素刺激巨噬細(xì)胞后CD14蛋白電泳圖；5B：5組細(xì)胞CD14蛋白水平統(tǒng)計(jì)圖

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可逆轉(zhuǎn)SLE外泌體對巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制作用，并上調(diào)巨噬細(xì)胞CD14的表達(dá)。上述結(jié)果為姜黃素作為SLE的治療藥物提供了有價(jià)值的線索，但仍需大量進(jìn)一步研究的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突