王加利，田婧鋆，顧娟，孫倩倩，郭曉宇，張伽妹，王春國，劉永剛*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029

菊科斑鳩菊屬驅(qū)蟲斑鳩菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd的成熟瘦果可供藥用，有散寒止痛、驅(qū)蟲、清除不正常黏液質(zhì)等效用，一般常用來治療白癜風(fēng)[1]。然而如今對其所含化學(xué)成分的研究還比較薄弱，經(jīng)查閱文獻可知，目前其中所明確的成分僅包括黃酮類、咖啡酰奎寧酸類、倍半萜類等[2]，并且還未發(fā)現(xiàn)使用LC-MS技術(shù)對其中的化學(xué)成分進行分析研究的報道。在本實驗中，通過研究咖啡?？鼘幩犷?、黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，利用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)對其乙醇提取物中的多酚類成分進行鑒定。通過對比各個化合物的精確分子質(zhì)量數(shù)據(jù)和生成的碎片離子等信息，以及使用對照品比對等方法對其乙醇提取物中的化學(xué)成分進行鑒別，為驅(qū)蟲斑鳩菊的藥效物質(zhì)研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與裝置

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)，配備熱噴霧離子源與Xcalibur 2.1工作站；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統(tǒng)；電子分析天平(德國Satorious公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 主要材料與試劑

驅(qū)蟲斑鳩菊購于新疆和田市艾比布拉阿吉維吾爾醫(yī)大藥房，由新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校木艾塔爾副教授鑒定為菊科植物驅(qū)蟲斑鳩菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.的成熟瘦果。純度大于98%的圣草酚、紫鉚查爾酮、異鼠李素、硫黃菊素、木犀草素、咖啡酸和3，5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯都是由本實驗室從驅(qū)蟲斑鳩菊藥材中分離得到的[3]，乙腈和甲酸(美國Thermo Fisher公司)均為質(zhì)譜級。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 精確稱量各對照品，加入一定量甲醇，超聲溶解，配制為1 mg·L-1的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取20 g驅(qū)蟲斑鳩菊，加入200 mL 80%乙醇，回流1 h后真空濃縮，水浴蒸干，加適量甲醇溶解，稀釋100倍，用0.22 μm的濾膜過濾，即可得。

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：25 ℃；流動相A和B分別為0.1%的甲酸水和乙腈，梯度洗脫程序為：0～1 min A相由98%降至85%，1～8 min A相由85%降至65%，8～9 min A相由65%降至40%，9～12 min A相由40%降至2%；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 HESI離子源，負離子檢測模式；鞘氣流速：40 L·h-1，輔助氣流速：20 L·h-1；離子源溫度：350 ℃；毛細管電壓-35 V；電離源電壓-4 kV；管狀透鏡電壓-110 V；樣品采用傅里葉變換高分辨全掃描(FT)，質(zhì)量掃描范圍m/z為150～1500；檢測分辨率為30 000；利用數(shù)據(jù)依賴性掃描獲得二三級質(zhì)譜，選擇上一級豐度最高的3個色譜峰進行碰撞誘導(dǎo)解離碎片掃描。

3 結(jié)果

3.1 對照品的LC-MS分析

3.1.1 黃酮類化合物的裂解規(guī)律 5個黃酮類成分在負離子模式下的一級和二級質(zhì)譜圖如圖1(A～E)所示。這5個黃酮類成分根據(jù)母核結(jié)構(gòu)可分為黃酮、二氫黃酮、黃酮醇、查耳酮、橙酮5種類型的黃酮類衍生物。木犀草素(A)屬于黃酮類化合物，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z285，與此同時也生成了1，3A-m/z151，這是經(jīng)RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子。在二級質(zhì)譜中，因為進一步的CID碎裂，產(chǎn)生了比較多的碎片離子，包括脫去H2O、CO、CO2、C3O2、C2H2O+CO2等中性分子形成m/z267、257、241、217、198等的碎片。圣草酚(B)屬于二氫黃酮類化合物，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z287，在二級質(zhì)譜中又發(fā)生了RDA裂解，得到1，3A-m/z151碎片離子。異鼠李素(C)屬于黃酮醇類化合物，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z315，二級質(zhì)譜中出現(xiàn)脫去-CH3(15 Da)的碎片離子m/z300。紫鉚查耳酮(D)為查耳酮類化合物，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z271，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的離子m/z253為其脫去H2O的碎片，且羰基發(fā)生α裂解形成m/z135的基峰。硫黃菊素(E)為橙酮類化合物，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z269，二級質(zhì)譜中出現(xiàn)脫去H2O、CO、CO2、C3O2而得到的m/z251、241、225、201碎片離子，還出現(xiàn)C環(huán)裂解碎片m/z135。由上述質(zhì)譜裂解規(guī)律可知，黃酮類成分在負離子模式下均能發(fā)生一系列中性小分子丟失，包括H2O、CO、CO2、C3O2及其組合碎片，但是不同黃酮類型丟失中性小分子的難易程度不同，主要表現(xiàn)為在二級質(zhì)譜中的相對豐度不同；黃酮類成分一般能夠在C環(huán)內(nèi)部發(fā)生包括RDA裂解在內(nèi)的多種裂解，因母核的不同使其裂解優(yōu)先次序也不相同；如果在黃酮母核中存在甲氧基取代，脫去甲基形成的離子是其特征碎片。以木犀草素為例的黃酮類化合物的裂解途徑如圖2所示。3.1.2 咖啡?？鼘幩犷惢衔锏牧呀庖?guī)律 圖1(F)為負離子模式下3，5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞サ亩嗉壻|(zhì)譜圖。其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z529；在二級質(zhì)譜中脫去一分子咖啡酸，得到單咖啡?？鼘幩峒柞/z367；在m/z367的三級質(zhì)譜中檢出m/z191[quinic]-、179[caffeoyloxy]-、161[caffeoyloxy-H2O]-、135[caffeoyloxy-CO2]-碎片離子，其裂解途徑如圖3所示。由此我們推測，咖啡?？鼘幩犷惢衔锏奶卣麟x子包括m/z191、179、161、135等。

注：A.木犀草素；B.圣草酚；C.異鼠李素；D.紫鉚查耳酮；E.硫黃菊素；F.3，5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯；MS1為一級質(zhì)譜；MS2為二級質(zhì)譜；MS3為三級質(zhì)譜。圖1 驅(qū)蟲斑鳩菊中6個多酚類化合物的質(zhì)譜圖

圖2 木犀草素的質(zhì)譜裂解途徑

圖3 3，5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞サ馁|(zhì)譜裂解途徑

3.2 驅(qū)蟲斑鳩菊中多酚類化合物結(jié)構(gòu)的快速鑒定

圖4為驅(qū)蟲斑鳩菊樣品經(jīng)UPLC-LTQ-Orbitrap分析后的典型總離子流色譜圖，可看出大部分成分分離良好。在本研究中，通過查閱有關(guān)的文獻、搜索一些數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，如Chemspider、Scifinder等，建立了92個斑鳩菊屬已知化合物的信息數(shù)據(jù)庫，包括化合物的分子式、結(jié)構(gòu)式和名稱。然后將該數(shù)據(jù)庫中各化合物的理論質(zhì)荷比導(dǎo)入質(zhì)譜分析軟件，若出現(xiàn)一級質(zhì)譜精確質(zhì)荷比與理論質(zhì)荷比誤差小于5的化合物，且二級質(zhì)譜滿足該類化合物的裂解規(guī)律及特征碎片信息，即認為它們是同一個化合物。通過此種方法，總共鑒定出43個多酚類化合物，其中包括30個黃酮類、9個咖啡?？鼘幩犷惡?個酚酸類化合物，其中有26個化合物為驅(qū)蟲斑鳩菊中新發(fā)現(xiàn)的化合物。表1羅列了UPLC-LTQ-Orbitrap-MS條件下鑒別的43個多酚類成分的保留時間、分子量、分子式和碎片離子信息。

圖4 負離子模式下驅(qū)蟲斑鳩菊80%乙醇水提取物的總離子流圖

3.2.1 黃酮類成分分析 在本實驗中所鑒別的30個黃酮類成分中，包括22個黃酮苷元和8個黃酮糖苷。在黃酮苷元的二級質(zhì)譜中出現(xiàn)了C環(huán)發(fā)生RDA裂解的特征離子碎片，并觀測到了中性丟失H2O、CO、CO2、C3O2和C2H2O的碎片，筆者再通過對照品比對或結(jié)合文獻報道鑒定了這22個黃酮苷元。例如化合物28，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z269，二級質(zhì)譜碎片包括m/z251[M-H-C3O2]-、241[M-H-CO]-、227[M-H-C2H2O]-、225[M-H-CO2]-、201[M-H-H2O]-、183[M-H-C2H2O-CO2]-、1511，3A-、1491，4B-+2H。以上碎片離子符合黃酮類化合物的裂解規(guī)律[4-5]，所以推斷其有可能為黃酮類，通過查閱文獻[6]，鑒定得此化合物為芹菜素。被鑒定的8個黃酮糖苷都為氧糖苷，在二級質(zhì)譜中均出現(xiàn)丟失一分子脫水葡萄糖(162 Da)的碎片。

3.2.2 咖啡?？鼘幩犷惓煞址治?化合物3、18和21有可能是單咖啡?？鼘幩?，因為其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-均為m/z353，主要的二級質(zhì)譜碎片為m/z191[quinic]-、179[caffeoyloxy]-、173[quinic-H2O]-和135[caffeoyloxy-CO2]-，再通過查閱文獻[7]2905鑒定化合物3、18和21分別為3-O-咖啡酰奎寧酸(3-CQA)、5-O-咖啡?？鼘幩?5-CQA)、4-O-咖啡?？鼘幩?4-CQA)。化合物12、13、16、20有可能是二咖啡酰奎寧酸，因為其分子離子峰[M-H]-均為m/z515，再根據(jù)其主要的二級質(zhì)譜碎片m/z353和單咖啡酰奎寧酸的特征離子m/z135、173、179、191等，再結(jié)合文獻[7]2906鑒定化合物12、13、16、20分別為1，3-DCQA、3，4-DCQA、1，5-DCQA、3，5-DCQA?；衔?7、32的分子離子峰[M-H]-都是m/z529，其主要的二級質(zhì)譜碎片為m/z367，與此同時在化合物碎片中也出現(xiàn)了單咖啡酰奎寧酸的特征離子；而m/z367比單咖啡?？鼘幩犭x子碎片m/z353多1個CH2(14 Da)，根據(jù)如上敘述，推測化合物27、32可能是甲基化二咖啡?？鼘幩幔ㄟ^比對對照品，可以確定這兩個化合物分別為3，4-O-二咖啡?？鼘幩峒柞ズ?，5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞ァ?/p>

3.2.3 酚酸類成分分析 化合物2、4通過與對照品原兒茶酸、咖啡酸的質(zhì)譜信息和保留時間比較，確定其分別為原兒茶酸、咖啡酸?；衔?5的分子離子峰[M-H]-為m/z193，二級質(zhì)譜碎片主要為m/z178[M-CH3]-、134[M-CO2]-，再結(jié)合文獻[7]2907可以推斷該化合物為咖啡酸甲酯?；衔?7的分子離子峰[M-H]-為m/z207，二級質(zhì)譜碎片主要為m/z179[M-C2H4]-、135[M-CO2]-，結(jié)合文獻[7]2907，綜合上述離子信息能判斷化合物37是咖啡酸乙酯。

4 討論

雖然在結(jié)構(gòu)鑒定方面，高分辨質(zhì)譜技術(shù)依然不能算是完美，但是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為快速分離和鑒定中藥活性成分有力手段[8-11]，且可以在比較短的時間內(nèi)完成。驅(qū)蟲斑鳩菊化學(xué)成分復(fù)雜，目前還不甚明確。在前期關(guān)于驅(qū)蟲斑鳩菊的實驗中，鑒定出14個化合物，本實驗中首先對前期所得多酚類化合物的質(zhì)譜裂解機制進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在負離子模式下均能發(fā)生RDA裂解及一系列中性小分子(H2O、CO、CO2、C3O2)的丟失，而咖啡?？鼘幩犷惢衔锶菀壮霈F(xiàn)丟失咖啡酸、CO2、H2O等分子的特征離子峰，根據(jù)所總結(jié)的裂解規(guī)律，對驅(qū)蟲斑鳩菊乙醇提取物中所含的多酚類化合物進行了快速識別，初步鑒定出30個黃酮類化合物、13個酚酸類化合物，其中有26個化合物為在驅(qū)蟲斑鳩菊中新發(fā)現(xiàn)的化合物。本研究通過建立高通量的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS方法，識別了43個多酚類化合物，為驅(qū)蟲斑鳩菊中多酚類成分的定性分析提供了一種高效且快速的分析方法。

表1 驅(qū)蟲斑鳩菊中多酚類化學(xué)成分的鑒定結(jié)果

續(xù)表1

注：*表示為該植物中新發(fā)現(xiàn)的化合物。