王英，吳慶柏，沈鵬，謝睿，季國忠，王宏剛

肝癌是人類較為常見的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中死亡率排第二位，而在女性腫瘤病人中，死亡率排第六位[1]。2008年，全球約有75萬新發(fā)肝癌病人，我國死亡者約占一半[2]。肝癌的早期診斷比較困難，血清中循環(huán)無細胞DNA聯(lián)合分子標(biāo)志物檢測有助于提高診斷率[3]。目前肝癌的臨床療效有限，亟需尋找有效的靶向藥物及新的作用靶點，改善病人預(yù)后。組蛋白去乙?；?HDAC) 催化組蛋白發(fā)生去乙酰化，應(yīng)用 HDAC 抑制劑可通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展。HDAC4 是屬于Ⅱ 類 HDACs，可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。短鏈脂肪酸被認為是有效的 HDAC 抑制劑，調(diào)控多種癌細胞的生長、分化以及凋亡過程。丁酸鈉(Sodium butyrate)是其中一種短鏈脂肪酸，可在腸道細菌分解纖維素時產(chǎn)生。丁酸鈉在1978年[4]被發(fā)現(xiàn)有抑制 HDAC 作用，顯示出潛在的抗肝癌作用[5]。丁酸鈉 能導(dǎo)致多種腫瘤細胞如結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化[6-7]，其機制可能是通過使組蛋白過乙?；l(fā)揮生物學(xué)作用。筆者研究丁酸鈉 對肝癌細胞HepG2的增殖、凋亡和細胞侵襲能力的影響，探討可能的作用機制。

本研究起止時間為2013年3月至2015年9月。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞系培養(yǎng)于含10%小牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。將含培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶置于含5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24～36小時換液1次，待細胞長至約80%單層時，用0.25%胰酶溶液進行消化、傳代，取生長良好的細胞進行實驗。

1.2 細胞活力測定(MTT法) 取對數(shù)生長期細胞，制成1×106個/毫升單細胞懸液，接種于96孔板，每孔180 μL，隨即加入不同濃度的丁酸鈉溶液20 μL，使藥物終濃度分別為0，0.5，1，2，5，10 mmol/L，每組設(shè)6個平行復(fù)孔，對照組加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，分別培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL，震蕩10 min，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度。

1.3 細胞周期和凋亡檢測(流式細胞儀檢測) 細胞培養(yǎng)于六孔板中，過夜貼壁，待細胞長至約80%時，用丁酸鈉處理細胞，使藥物終濃度分別為0，1，5，10 mmol/L，24 h后胰酶消化，收集細胞，PBS清洗細胞2次(1 000 r/min，5 min)，予100 μg/mL 核糖核酸酶(RNase)處理，50 μg/mL 碘化丙啶(PI)避光染色，流式細胞儀檢測細胞周期。細胞凋亡按照Annexin V-FITC試劑盒操作說明進行操作，流式細胞儀檢測。

1.4 細胞侵襲實驗(Transwell侵襲實驗) 將-20 ℃保存的Matrigel置于冰上過夜融化，制備稀釋的含Matrigel液體，加入到Transwell上室，覆蓋整個聚碳酸酯膜，置于細胞培養(yǎng)箱使Matrigel 聚合成凝膠。將已用不同濃度丁酸鈉處理24 h的HepG2細胞接種于Transwell培養(yǎng)板上室，下室加入500 μL含10%小牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去上室Matrigel 凝膠和聚碳酸酯膜上表面的細胞。小心取出上室，用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色1 min。小心將聚碳酸酯膜自上室基底切取下來，置載玻片上，中性樹脂封片。附著于聚碳酸酯膜下表面的細胞在顯微鏡下觀察。將聚碳酸酯膜分為100個網(wǎng)格，按隨機數(shù)字表法選取10個網(wǎng)格在高倍鏡下(400倍)觀察侵襲細胞并計數(shù)，取平均數(shù)。

1.5 免疫熒光實驗 對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗滌后，予多聚甲醛固定細胞，再進行通透處理，通透后用PBS洗滌，使用封閉液對細胞進行封閉，抗體孵育4 ℃過夜。PST漂洗后加入二抗，室溫避光孵育1 h，漂洗后封片，熒光顯微鏡檢測。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 用PBS洗滌各組細胞3次，每孔加入蛋白裂解液，在冰上裂解30 min后，立即用細胞刮棒刮下細胞，4 ℃離心后取上清液，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴鍋中變性。每組按50 μL蛋白上樣量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用150 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后，加二抗室溫孵育1 h，PBS漂冼。暗室內(nèi)加入ECL發(fā)光液，X線片感光，顯影，定影。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉抑制HepG2細胞的增殖能力 不同濃度(0.5、1、2、5、10 mmol/L)丁酸鈉對 HepG2細胞的增殖能力的影響不同。低濃度(0.5 mmol/L) 丁酸鈉處理 24 h后對細胞生長有輕微的促進作用。但隨著丁酸鈉濃度的增加(1、2、5、10 mmol/L)和處理時間的延長(24、48、72 h)，HepG2細胞呈現(xiàn)出明顯的生長抑制狀態(tài)(圖1)。10 mmol/L丁酸鈉處理HepG2細胞24、48和72 h后，活細胞百分比分別為64.3%、41.7%、9.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=212.8，P<0.001)。

圖1 丁酸鈉抑制HepG2細胞的增殖能力

2.2 丁酸鈉影響HepG2細胞周期分布 不同濃度(0、1、5、10 mmol/L)丁酸鈉 處理HepG2 細胞24 h后，流式細胞技術(shù)檢測細胞周期。1 mmol/L 丁酸鈉處理后，HepG2 細胞G1期細胞比例稍增加，S期細胞比例稍減少。但隨著丁酸鈉濃度的增加，細胞周期明顯發(fā)生阻滯，G1期細胞比例明顯增加，而S期細胞比例明顯減少(圖2)。0、1、5、10 mmol/L丁酸鈉處理HepG2細胞24 h后，S期細胞比例分別為27.4%、29.1%、12.8%、10.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.7，P<0.001)。

2.3 丁酸鈉誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡 與對照組(0 mmol/L丁酸鈉)相比，不同濃度(1，5，10 mmol/L)丁酸鈉處理HepG2細胞24 h后，凋亡細胞百分比明顯增加，早期凋亡率分別為2.7%，4.5%，6.5%，6.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.1，P=0.001)。這提示丁酸鈉對HepG2細胞的促凋亡作用呈藥物濃度依賴性(圖3)。

圖2 丁酸鈉影響HepG2細胞周期分布:A為不同濃度(0，1，5，10 mmol/L)丁酸鈉處理HepG2細胞24 h后，細胞周期的變化；B為丁酸鈉處理后，細胞周期G1期、S期、G2期的量化

注：與對照組(0 mmol/L丁酸鈉)相比，aP<0.05圖3 丁酸鈉誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡：A為不同濃度(0，1，5，10 mmol/L)丁酸鈉處理HepG2細胞24 h后，細胞凋亡增加；B為丁酸鈉處理后，凋亡細胞百分比的量化

2.4 丁酸鈉抑制HepG2細胞侵襲能力 本研究采用Transwell小室實驗檢測丁酸鈉對肝癌細胞的侵襲能力。高濃度丁酸鈉明顯抑制了HepG2細胞的侵襲，并呈藥物濃度依賴性(圖4)。相對于0 mmol/L丁酸鈉組，1、5、10 mmol/L丁酸鈉組的侵襲細胞百分比分別降至72.7%、41.7%、21.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=202.1，P<0.001)。

2.5 HDAC4蛋白在HepG2細胞中的表達及定位應(yīng)用免疫熒光法檢測HDAC4蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)HDAC4在HepG2細胞中表達陽性，細胞質(zhì)和細胞核均有一定程度的表達，但主要位于細胞質(zhì)(圖5)。

2.6 丁酸鈉顯著抑制HDAC4蛋白表達 丁酸鈉是一種HDAC抑制劑，可使組蛋白過乙?；２煌瑵舛榷∷徕c處理HepG2細胞后，Western Blot法檢測HDAC4 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)隨著處理濃度的增加，HDAC4表達顯著減少(圖6)。

圖6 丁酸鈉顯著抑制HDAC4蛋白表達

3 討論

HDAC4屬于Ⅱ類 HDACs，與多種生物學(xué)過程有關(guān)，比如神經(jīng)退行性疾病[8]，內(nèi)分泌疾病[9-10]。組蛋白乙酰化過程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]?？梢酝茰y，HDAC4 的抑制劑可能對肝癌有治療作用。丁酸鈉作為一種去乙酰化酶抑制劑，能夠提高組蛋白乙?；絒13]。研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉 能夠抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞衰老和凋亡等，這可能與其提高組蛋白乙?；嘘P(guān)。丁酸鈉已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤的臨床研究，現(xiàn)已廣泛用于畜禽飼料添加。丁酸鈉能抑制大部分HDACs，除了Ⅲ類HDACs和 HDAC6、HDAC10[14]。丁酸鈉對多種腫瘤細胞均有抑制作用。丁酸鈉可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、骨髓瘤等多種腫瘤細胞凋亡，尤其在消化系統(tǒng)腫瘤的誘導(dǎo)分化和凋亡成為近年研究熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉是一種具有HDAC4抑制劑活性的短鏈脂肪酸。丁酸鈉能抑制HepG2肝癌細胞中HDAC4的表達。隨著處理濃度的增加，丁酸鈉明顯抑制HepG2細胞生長增殖能力，調(diào)控細胞周期，促進HepG2細胞凋亡，抑制細胞侵襲能力，但其具體作用機制還不清楚。有學(xué)者認為組蛋白去乙酰化酶抑制劑apicidin抑制了HDAC4的表達，從而抑制卵巢癌細胞的遷移[15]。研究認為HDAC4可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[16]。我們推測，丁酸鈉可能通過抑制HDAC4而發(fā)揮作用。HDAC4屬于Ⅱ類HDACs，主要表達于細胞質(zhì)，但細胞核中也有，提示HDAC4在細胞質(zhì)和細胞核之間可能存在信號傳遞的作用，有研發(fā)靶向HDAC4抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用前景[17]。那么，丁酸鈉是否通過抑制HDAC4而在基因水平調(diào)控腫瘤信號通路？我們下一步研究將構(gòu)建HDAC4干擾載體，研究HDAC4下游的靶分子及其參與的信號途徑，以進一步探討肝癌的發(fā)生發(fā)展的機制。

總之，本研究認為丁酸鈉抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制細胞侵襲能力。我們推測丁酸鈉可能通過抑制HDAC4，靶向調(diào)控肝癌的進展，為研發(fā)新型化療藥提供依據(jù)。

圖4 丁酸鈉抑制HepG2細胞侵襲能力(0.1%結(jié)晶紫染色×100):A為0 mmol/L丁酸鈉；B為1 mmol/L丁酸鈉；C為5 mmol/L丁酸鈉；D為10 mmol/L丁酸鈉

注：綠色為HDAC4，藍色為細胞核圖5 HDAC4蛋白在HepG2細胞中的表達及定位(免疫熒光染色HDAC4，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色細胞核，×400)