李曉波，付 瑞，王 吉，王淑菁，李 威，王莎莎，秦 驍，黃宗文，賀爭鳴，岳秉飛*，趙德明

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094； 2.中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所，北京 102629)

小鼠諾如病毒(murine norovirus, MNV)目前在我國的實(shí)驗(yàn)小鼠中有很高的感染率[1-2]，小鼠感染MNV后大多無任何臨床癥狀，但病毒可在體內(nèi)長期存在并通過糞便排毒，污染飼養(yǎng)環(huán)境，繼而感染其他個(gè)體[3]，我國的實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)目前還不要求對MNV進(jìn)行檢測，因此很多實(shí)驗(yàn)用的小鼠均為MNV陽性鼠。研究發(fā)現(xiàn)MNV感染129小鼠會致其脾中B細(xì)胞含量顯著增加[4]，129小鼠為免疫功能正常小鼠，表明MNV感染會使正常小鼠免疫功能發(fā)生改變。本研究選取國內(nèi)常用的KM，BALB/c，BALB/c-nu，C57BL/6及NIH等五個(gè)品系小鼠，對其感染MNV后外周血中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測分析，以評估對小鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

五個(gè)品系的KM，BALB/c，NIH，C57BL/6及BALB/c-nu小鼠(體重分別為30～32 g,18～20 g,20～22 g,16～18 g及16～18 g)，SPF級，雌性，6周齡，每個(gè)品系各20只，購自國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心[SCXK(京)2014-0013]，動物實(shí)驗(yàn)于中國食品藥品檢定研究院屏障動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(京)2017-0013]，本實(shí)驗(yàn)所用水、鼠料及墊料均經(jīng)過滅菌處理，并按實(shí)驗(yàn)動物的3R原則給予人道關(guān)懷，已通過福利倫理審查[IACUC號：中檢動(福)第2018(B)020號]。

1.1.2 病毒

小鼠諾如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，TCID50為10-4.625/0.1 mL，本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器

FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD8a、PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD49b、細(xì)胞因子檢測試劑盒(LEGENDplexTMMulti-Analyte Flow Assay Kit)等均為BioLegend產(chǎn)品；RBC Lysing Solution(10×)購自Bio-Rad。流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號LSRII)；離心機(jī)(德國Hettich公司，型號MIKRO 22R)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及病毒的接種

每個(gè)品系小鼠分為感染組和對照組，每組各10只，感染組灌胃感染0.2 mL MNV病毒液，對照組灌胃0.2 mL的生理鹽水。分別于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天從眼周靜脈采集抗凝血，動物采血前于密封容器經(jīng)CO2麻醉5～8 s，每次采集大約200 μL，200 r/min離心10 min，分離血細(xì)胞及血漿。

1.3.2 免疫細(xì)胞的檢測

分離得到的血細(xì)胞，加入與血漿等體積的PBS重懸，每流式管中加入100 μL，按照檢測組合加入最佳反應(yīng)量的熒光標(biāo)記抗體，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min，每管加入用去離子水稀釋10倍的紅細(xì)胞裂解液工作液2 mL，混勻后室溫避光孵育10 min；1500 r/min離心5 min棄上清，加入PBS洗液(含1% FBS的PBS)2 mL混勻后1500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS洗液，混勻后及時(shí)上機(jī)檢測，測定總T細(xì)胞(CD3+)、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、總B細(xì)胞(CD3-CD19+)、NK細(xì)胞(CD3-CD49b+)及NK-T細(xì)胞(CD3+CD49b+)占總淋巴細(xì)胞(CD45+)的百分比。

1.3.3 細(xì)胞因子檢測

反應(yīng)板每孔加100 μL洗液，室溫靜置1 min，倒棄，拍干，將標(biāo)準(zhǔn)品和待檢血漿樣品用稀釋液1∶2稀釋，每孔加50 μL，偶聯(lián)不同細(xì)胞因子捕獲抗體的熒光微球，渦旋振蕩30 s，每孔加25 μL，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育2 h，每孔加200 μL洗液，真空抽濾吸干，洗滌2次。每孔加生物素標(biāo)記的檢測抗體25 μL，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育1 h，每孔直接加入25 μL鏈霉親和素-藻紅素(SA-PE)，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育30 min。洗板后，每孔加150 μL洗液，振蕩器重懸微球1 min，在流式細(xì)胞儀讀取數(shù)據(jù)，測定IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF等13種細(xì)胞因子的含量。

1.3.4 結(jié)果分析

(1)感染組和對照組免疫細(xì)胞總體均值的比較：比較感染組和對照組感染MNV后第7、14、21、28天的總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、總B細(xì)胞、NK細(xì)胞及NK-T細(xì)胞含量的總體均值。

(2)感染組和對照組細(xì)胞因子總體均值比較：比較感染組和對照組感染MNV后第7、14、21、28天的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF共13種細(xì)胞因子的總體均值，結(jié)果以柱狀圖來表示。

(3)不同時(shí)間點(diǎn)免疫細(xì)胞百分比含量變化分析：根據(jù)感染MNV后第0、7、14、21、28天各時(shí)間點(diǎn)各群細(xì)胞的均值和標(biāo)準(zhǔn)差繪制曲線圖，分析各免疫細(xì)胞的變化趨勢。

(4)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子含量變化分析：繪制感染MNV后第0、7、14、21、28天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)各細(xì)胞因子的含量均值和標(biāo)準(zhǔn)差的曲線圖，分析細(xì)胞因子含量的變化趨勢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 感染組和對照組免疫細(xì)胞含量總體均值比較

KM小鼠感染組總T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞相比對照組均顯著升高(P<0.01)，總B細(xì)胞相比對照組顯著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值相比對照組顯著升高(P<0.05)。CD8+T細(xì)胞、NK及NK-T細(xì)胞與對照組比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BALB/c小鼠感染組CD8+T細(xì)胞相比對照組顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)兩組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C57小鼠感染組相比對照組CD4+、CD8+T細(xì)胞均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，總B細(xì)胞顯著升高(P<0.05)，其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIH小鼠感染組總T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞相比對照組均顯著升高(P<0.01)，總B細(xì)胞顯著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BALB/c-nu小鼠各群細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 感染組和對照組細(xì)胞因子含量均值比較

KM小鼠感染組CXCL10的含量顯著低于對照組(P<0.01)，其余細(xì)胞因子含量比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)；BALB/c小鼠IFN-γ含量感染組顯著高于對照組(P<0.01)，其余細(xì)胞因子含量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1B)；BALB/c-nu小鼠CCL2含量感染組顯著高于對照組(P<0.05)，TNF-α、CXCL1及CXCL10感染組含量均顯著高于對照組(P<0.01)，而IFN-β含量感染組顯著低于對照組(P<0.05)，其余細(xì)胞因子含量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1C)；C57小鼠IL-10含量感染組顯著高于對照組(P<0.05)，CCL5及GM-CSF含量感染組顯著低于對照組(P<0.05)，其余細(xì)胞因子含量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1D)；NIH小鼠各細(xì)胞因子含量均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1E)。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：BALB/c-nu小鼠；D：C57小鼠；E：NIH小鼠。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 不同品系小鼠感染組和對照組細(xì)胞因子含量比較Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, BALB/c-nu mice. D, C57 mice. E, NIH mice. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 1 Comparison of cytokine levels between the infection and control groups of different mouse strains

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)免疫細(xì)胞百分比含量變化分析

KM小鼠感染組和對照組總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及總B細(xì)胞均在感染第7天即已產(chǎn)生差異(P<0.05)，感染組相較對照組總T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞含量升高，總B細(xì)胞含量降低，后面的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均比較明顯(圖2A)；BALB/c小鼠CD8+T細(xì)胞在第感染第7天感染組和對照組均值一致，在第14、21天感染組均值均明顯低于對照組(P<0.05)，第28天兩組均值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2B)；C57小鼠CD4+T細(xì)胞含量感染組均值在第7天即低于對照組(P<0.05)，直到第28天差異仍明顯。總B細(xì)胞雖然第7天和第14天感染組均值均高于對照組，但差值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第21天和第28天兩組差異顯著(P<0.05)。CD8+T細(xì)胞含量在第7，14天均無顯著差異，到第21天感染組均值明顯低于對照組，第28天差異極顯著(P<0.01)(圖2C)；NIH小鼠總T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在第7天兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第14天開始感染組高于對照組(P<0.05)，第21天和第28天維持穩(wěn)定?？侭細(xì)胞均值第7天兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第14天及第21天感染組低于對照組(P<0.05)，第28天兩組差異極顯著(P<0.01)(圖2D)。

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：C57小鼠；D：NIH小鼠。圖2 不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠免疫細(xì)胞均值變化曲線比較Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, C57 mice. D, NIH mice.Figure 2 Comparison of the changes of mean values of immune cell levels in the two groups of mice at different time points

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子含量變化分析

KM小鼠CXCL10含量在感染第7天兩組無明顯差異，到第14天感染組低于對照組(P<0.05)，后面兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)維持穩(wěn)定(圖3A)；BALB小鼠IFN-γ含量在第7天雖然感染組均值高于對照組，但差異不明顯(P>0.05)，至第14天差異明顯(P<0.05)，第21天感染組均值降低，差異仍明顯(P<0.05)，至第28天兩組差異不顯著(P>0.05)(圖3B)；C57小鼠GM-CSF含量第7天兩組無明顯差異，第14天感染組均值低于對照組，但差異不明顯(P>0.05)，第21天產(chǎn)生明顯差異(P<0.05)，第28天感染組均值進(jìn)一步降低，差異極顯著(P<0.01)。CCL5含量第7天兩組無明顯差異，第14天開始感染組低于對照組(P<0.05)，第21、28天差異仍明顯。IL-10含量第7天開始感染組高于對照組(P<0.05)，一直到第28天兩組差異仍明顯(圖3C)；BALB/c-nu小鼠TNF-α含量在第7天感染組即高于對照組(P<0.05)，第14、21天差異顯著(P<0.01)，第28天感染組含量降低，兩組差異不明顯(P>0.05)。CCL2含量在第7和14天感染組低于對照組(P<0.05)，至第21天和28天雖然感染組均值低于對照組，但兩者差異不明顯(P>0.05)。IFN-β兩組含量在第7天開始出現(xiàn)差異(P<0.05)，一直持續(xù)到第28天差異仍顯著(圖3D)；CXCL10含量在感染第7天兩組之間無差異，至第14及21天感染組高于對照組(P<0.05)，第28天雖然感染組均值高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。感染組CXCL1含量在第7天即高于對照組(P<0.05)，后續(xù)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量維持平穩(wěn)(圖3E)。

3 討論

目前分離的MNV毒株少數(shù)為急性感染株(如MNV-1株)，可在感染動物后幾天被清除，大多為持續(xù)感染株(如MNV-2, MNV-3, MNV-4, CR1,等)，可在動物體內(nèi)長期存在[4-8]。免疫功能健全的小鼠感染MNV無明顯臨床癥狀，但病毒可在動物體內(nèi)長期存在并通過糞便向外排毒，研究發(fā)現(xiàn)MNV感染129小鼠會致其脾中B細(xì)胞含量顯著增加，但所用毒株為急性株，同時(shí)僅檢測了一個(gè)品系的小鼠(129小鼠)[4]，而我國普遍感染的是MNV慢性株，本研究所用毒株分離自國內(nèi)一實(shí)驗(yàn)動物使用場所，屬慢性株[9-10]，所研究品系包括國內(nèi)常用的KM、BALB/c、BALB/c-nu、C57及NIH小鼠，研究MNV感染對不同品系小鼠免疫功能的影響。之所以選擇外周血進(jìn)行檢測，一是由于脾中的所有淋巴細(xì)胞均直接來源于血液，一直與血液進(jìn)行交換，維持著動態(tài)平衡[11]，外周血中免疫細(xì)胞及因子含量變化能較直觀的反應(yīng)動物的免疫狀態(tài)；二是考慮到外周血可多次采集，對動物損傷較輕，可實(shí)現(xiàn)對同一批動物的多次檢測，避免不同批動物間的差異；另外采集外周血操作簡便，影響結(jié)果的因素較少。我們參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]分別于MNV感染前(第0天)及感染后的第7、14、21、28天采集外周血，同時(shí)設(shè)立同樣數(shù)量的對照組，對這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組動物的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測，一是比較兩組各指標(biāo)在即感染MNV后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)總體均值的差異，二是繪制每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(包括第0天)的均值變化曲線，分析各指標(biāo)含量的變化趨勢。

免疫系統(tǒng)通過固有免疫以及特異性免疫發(fā)揮作用，特異性免疫又包括T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。CD3+作為成熟T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志，其數(shù)量可間接反映機(jī)體的免疫功能水平[14]，T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分為CD4+和CD8+細(xì)胞， CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞，并促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞及活化巨噬細(xì)胞，CD8+T淋巴細(xì)胞具有殺傷靶細(xì)胞的功能，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量及CD4+/ CD8+比值平衡是維持機(jī)體免疫功能的關(guān)鍵[15]。B淋巴細(xì)胞在脾中分化成漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，發(fā)揮體液免疫作用，CD19是B細(xì)胞表面的主要標(biāo)志。NK和NK-T細(xì)胞均屬于固有免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞殺傷活性無MHC 限制，不依賴抗體，主要分布于外周血中，NK-T細(xì)胞既有T細(xì)胞受體，又有NK細(xì)胞受體，可通過分泌大量細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，活化后具有NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性。本研究選擇檢測外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、總B細(xì)胞(CD3-CD19+)、NK細(xì)胞(CD3-CD49b+)及NK-T細(xì)胞(CD3+CD49b+)百分比含量來評價(jià)MNV感染對小鼠固有免疫和特異性免疫的影響。細(xì)胞因子根據(jù)功能不同可分為干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及趨化因子等。干擾素根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)不同可分為INF-α、INF-β和IFN-γ，分別由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和活化T細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-γ主要由I型輔助性T細(xì)胞(Th1)產(chǎn)生，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等特性，多個(gè)研究表明，IFN是體內(nèi)外抑制MNV復(fù)制所必須的[4,12,16-18]；白細(xì)胞介素由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或其他非單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生，其中IL-1β在免疫應(yīng)答和組織修復(fù)中起作用，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能刺激集落刺激因子、血小板生長因子等的生成和促使T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。II型輔助T細(xì)胞(Th2)主要產(chǎn)生IL-6、IL-10，起輔助體液免疫作用[19]，IL-12由抗原提呈細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生，能誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生；腫瘤壞死因子根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)不同，可分為TNF-α和TNF-β兩類，前者由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[20-21]，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，并對中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)的活化和趨化作用[22]；根據(jù)集落刺激因子的作用范圍，可將其分為粒細(xì)胞CSF(G-CSF)，巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)，粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和多能集落刺激因子。它們可促進(jìn)不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞增殖和分化；趨化因子在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，可分為C、CC、CXC和CX3C等4個(gè)亞族，大多屬CC和CXC兩族[23]，前者趨化單核細(xì)胞，包括CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、MCP-2及MCP-3等，后者趨化中性粒細(xì)胞，包括CXCL1(KC)、CXCL10(IP-10)等。本研究選擇INF-α、INF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、 IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、 CXCL10和GM-CSF等13種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以期較全面評估MNV感染小鼠后各免疫細(xì)胞發(fā)揮作用的情況。

正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子含量受各種因素的影響，目前還沒有統(tǒng)一的權(quán)威數(shù)據(jù)，本研究對照組小鼠各免疫指標(biāo)所測得數(shù)據(jù)均與已有報(bào)道一致[11,15,19,21]。結(jié)果顯示KM小鼠感染組CD3+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞含量均顯著高于對照組(P值均小于0.01)，CD4+/ CD8+比值感染組顯著高于對照組(P=0.048)；B細(xì)胞含量則顯著低于對照組(P值小于0.01)，趨化因子CXCL10含量感染組低于對照組(P<0.01)，其他兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明MNV感染會引起KM小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答活躍來發(fā)揮抗病毒作用，B細(xì)胞比例降低可能是由于T淋巴細(xì)胞含量增加所致。BALB/c小鼠CD8+T細(xì)胞感染組低于對照組(P值小于0.05)，CD4+/ CD8+比值及其他細(xì)胞差異不明顯，結(jié)合其IFN-γ含量感染組高于對照組(P<0.05)，推測BALB/c小鼠主要通過活化的輔助T細(xì)胞來抗MNV感染。與KM小鼠相反，C57小鼠感染組相比對照組CD4+T細(xì)胞(P<0.05)和CD8+T細(xì)胞(P<0.01)含量均明顯降低，B細(xì)胞含量則顯著升高(P<0.05)，同時(shí)IL-10含量增加(P<0.05)，IL-10可抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性活性分子，并抑制T細(xì)胞參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，其高表達(dá)與免疫細(xì)胞的抑制高度有關(guān)[24]，另外感染組CCL5及GM-CSF含量均顯著低于對照組(P<0.05)，推測MNV的感染可能會增強(qiáng)C57小鼠的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)會抑制單核細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。NIH小鼠感染組總T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞含量顯著高于對照組(P值均小于0.01)，CD4+T細(xì)胞兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD4+/ CD8+比值顯著低于對照組(P<0.05)，B細(xì)胞含量顯著降低(P<0.01)，而各細(xì)胞因子兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明NIH小鼠可能主要通過細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)殺傷活性來抗MNV感染。BALB/c-nu小鼠為T細(xì)胞免疫缺陷小鼠，其感染組和對照組各免疫細(xì)胞含量均無顯著差異，而感染組相比對照組TNF-α、CCL2、 CXCL1、CXCL10含量均顯著升高(P<0.01)，推測BALB/c-nu小鼠主要通過活化巨噬細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子趨化并激活單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞來發(fā)揮抗MNV效應(yīng)，INF-β含量降低(P<0.05)，可能是MNV持續(xù)感染株抑制IFN-β的釋放所致[25]。各品系小鼠NK及NK-T細(xì)胞的含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明NK或NK-T細(xì)胞在抗MNV感染中未發(fā)揮明顯作用。上述結(jié)果表明MNV感染對不同品系小鼠免疫指標(biāo)的影響各不相同，有的指標(biāo)變化甚至相反，如KM小鼠CD4細(xì)胞升高而C57小鼠降低，有的則沒有變化，如BALB/c-nu小鼠各免疫細(xì)胞含量兩組間均無顯著差異，有報(bào)道MNV感染會加劇Mdr1a-/-小鼠炎癥性腸病模型的疾病進(jìn)程，而對Smad3缺陷小鼠炎癥性腸病模型則無影響[26]，這可能與MNV對不同小鼠免疫系統(tǒng)影響不同有較大關(guān)系。盡管MNV感染對小鼠免疫指標(biāo)有明顯影響，所有小鼠從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束均未觀察到臨床癥狀，體重變化也無差異(數(shù)據(jù)未顯示)，但多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)MNV感染會導(dǎo)致小鼠肝、脾、肺及腸道等組織病理學(xué)病變，肝會出現(xiàn)炎性細(xì)胞病灶，脾會發(fā)生紅髓增生，白髓活化，嚴(yán)重的壞死或纖維化[26]，這可能與其引起的免疫應(yīng)答有關(guān)。

對總體均值有差異的各指標(biāo)繪制各時(shí)間點(diǎn)的變化曲線，分析發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠在感染MNV后各免疫指標(biāo)隨時(shí)間變化的規(guī)律有所不同，KM小鼠在感染第7天兩組均值即產(chǎn)生顯著差異，一直持續(xù)到第28天差異仍顯著，說明KM小鼠免疫系統(tǒng)對MNV感染應(yīng)答較快且更持久。BALB/c及BALB/c-nu小鼠各指標(biāo)大多在第7天無顯著差異，第14，21天均有顯著差異，至第28天感染組均值恢復(fù)正常，兩組差異不顯著，此時(shí)動物體內(nèi)仍存在病毒(數(shù)據(jù)未顯示)，表明這兩個(gè)品系小鼠對MNV感染的免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間較短，推測MNV更易在這兩個(gè)品系形成潛伏感染。C57和NIH小鼠各免疫指標(biāo)大多在感染MNV第14天才出現(xiàn)顯著差異，直到第28天差異仍顯著，我們沒有進(jìn)行更長時(shí)間的比較，推測兩組均值的差異仍可維持一段時(shí)間?？傮w來說，MNV感染對BALB/c及BALB/c-nu小鼠免疫功能影響時(shí)間較短，對KM、C57及NIH小鼠影響時(shí)間相對較久。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)非常復(fù)雜，要更全面的了解MNV感染對動物免疫功能的影響，還需進(jìn)一步的研究。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究未進(jìn)行MNV急性株的比較分析，需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)充?？傊?，本研究的結(jié)果表明MNV的感染會對常用小鼠的免疫功能造成一定的影響，而且不同品系的動物影響也不同，建議在進(jìn)行免疫相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)如藥效評價(jià)、疫苗評價(jià)時(shí)選擇MNV陰性小鼠，以避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。