黃少勇，蔡潤(rùn)澤，陳永昌*

(1.昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500； 2.云南中科靈長(zhǎng)類(lèi)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500)

神經(jīng)管缺陷也被稱(chēng)作神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)，其發(fā)病率僅次于先天性心臟病，是最常見(jiàn)先天性畸形[1]之一，通常是由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合不完全或者不閉合造成的。NTDs一旦發(fā)生則不可逆轉(zhuǎn)，多在孕期流產(chǎn)或出生后很短的時(shí)間內(nèi)死亡[2]。目前，盡管已有神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前診斷方法，但是全球每年有超過(guò)30萬(wàn)的NTDs嬰兒出生，而患有NTDs的嬰兒有較高的死亡率，十分之一患有NTDs的嬰兒會(huì)在第一年死亡[3]。神經(jīng)管畸形可分為無(wú)腦兒(anencephaly)、腦膨出(encephalocele)、脊柱裂(spina bifida)和顱脊柱裂(craniorachischisis)等幾種類(lèi)型。NTDs在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到0.5‰～2‰[4]，并且在不同的地區(qū)發(fā)病率也有著較大的差別。神經(jīng)管閉合依賴(lài)于肌球蛋白收縮的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程例如根尖收縮，組織和細(xì)胞定向重排等過(guò)程[5]。NTDs的發(fā)生不僅受遺傳因素影響，也受到環(huán)境因素共同影響，目前常用補(bǔ)充葉酸(folic acid，F(xiàn)A)的方法來(lái)預(yù)防神經(jīng)管缺陷的發(fā)生，妊娠前和妊娠早期補(bǔ)充適量的葉酸可以降低60%～70%的NTDs的發(fā)生[6]。此外，體外胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)葉酸對(duì)神經(jīng)分化具有促進(jìn)作用[7]。因此，在對(duì)神經(jīng)管畸形的發(fā)生及其致病機(jī)制的研究中，大部分研究的焦點(diǎn)主要集中在葉酸代謝通路及其相關(guān)基因，但補(bǔ)充葉酸只能預(yù)防NTDs并不能阻止它的發(fā)生且葉酸預(yù)防NTDs發(fā)生的具體分子機(jī)制尚不清楚[7]。了解研究神經(jīng)管缺陷的致病機(jī)制有助于人們對(duì)NTDs的治療。近年來(lái)科學(xué)家通過(guò)對(duì)小鼠、非洲爪蟾等神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型的研究表明，平面細(xì)胞極性(planar cell polarity，PCP)信號(hào)通路在神經(jīng)管閉合的過(guò)程中起著很重要的作用，PCP信號(hào)通路及其相關(guān)基因也成為研究神經(jīng)管畸形遺傳基礎(chǔ)的熱點(diǎn)之一。因此，建立合適的動(dòng)物模型對(duì)了解神經(jīng)管缺陷的致病機(jī)制，進(jìn)而更好地研究預(yù)防和治療NTDs至關(guān)重要。

1 PCP信號(hào)通路

神經(jīng)胚的形成是胚胎發(fā)育中的一個(gè)基本過(guò)程。神經(jīng)胚的發(fā)育影響神經(jīng)管的發(fā)育，而大腦和脊柱的前體是神經(jīng)管[8]。神經(jīng)管是在胚胎發(fā)育過(guò)程中由大腦和脊髓的中樞神經(jīng)形成的一個(gè)瞬態(tài)結(jié)構(gòu)[7]。神經(jīng)管的閉合是由神經(jīng)板的折疊、升高、結(jié)合、在背側(cè)中線處融合，從而形成神經(jīng)管[9]。在這一過(guò)程中的任何一個(gè)步驟發(fā)生中斷就會(huì)導(dǎo)致NTDs，例如脊柱裂、無(wú)腦兒、無(wú)腦畸形和顱脊柱裂[7]。因此在神經(jīng)管閉合的過(guò)程中每一步都顯得至關(guān)重要，而在整個(gè)過(guò)程中PCP信號(hào)通路有著關(guān)鍵作用。PCP信號(hào)通路也被稱(chēng)為非典型Wnt信號(hào)通路，它調(diào)節(jié)與基底垂直的上皮片的極性[10]。最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)PCP信號(hào)通路，其影響果蠅翅膀體毛排列和復(fù)眼等高度有序化結(jié)構(gòu)的形成[11]。在哺乳動(dòng)物中，節(jié)點(diǎn)纖毛的定位以及內(nèi)耳的纖毛和皮膚上的毛囊中都發(fā)現(xiàn)了PCP信號(hào)通路的存在[12]。Adler等人[13]的研究表明，PCP信號(hào)通路在進(jìn)化上非常保守。PCP核心蛋白會(huì)形成一個(gè)比較復(fù)雜的膜復(fù)合體，這些蛋白質(zhì)的數(shù)量和亞細(xì)胞分布對(duì)胚胎發(fā)育中原腸胚的形成以及神經(jīng)胚形成過(guò)程中的PCP信號(hào)通路成員的匯聚延伸(convergent extension，CE)發(fā)揮著重要的作用[14]。CE是指在原腸胚形成的后期，神經(jīng)管在后腦與頸部交界的區(qū)域閉合，神經(jīng)管的閉合要求底板細(xì)胞群向中線匯聚延伸的一個(gè)過(guò)程[15]。CE是由非典型Wnt/Frizzled信號(hào)通路控制。與典型Wnt信號(hào)通路不同的是，非典型Wnt信號(hào)通路是通過(guò)β-actin穩(wěn)定的控制細(xì)胞的命運(yùn)，即果蠅中PCP通路[16]，而且CE這一過(guò)程的發(fā)生是由細(xì)胞的極化重排驅(qū)動(dòng)的[17]。因此PCP通路驅(qū)動(dòng)CE讓細(xì)胞發(fā)生重新形成神經(jīng)板，SHROOM3、VANGL2和WNT5A基因通過(guò)改變細(xì)胞形態(tài)使神經(jīng)板折疊直至神經(jīng)管閉合形成。

2 PCP通路的相關(guān)基因

PCP通路包括以下6個(gè)核心基因：FRIZZLED(FZ)，DISHEVELLED(DSH/DVL)，STRABISMUS/VANGOGH(STAM/VANGL)，F(xiàn)LAMINGO(FMI)/CELSR，PRICKLE(PK)和DIEGO(DGO)等[20]。果蠅FZ基因在多年前就被發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)平面極性[21]，而且FZ蛋白參與了幾乎所有的Wnt信號(hào)通路。但不同的FZ蛋白參與不同的通路，在中樞神經(jīng)中神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)以及方向定位中就有FZD3蛋白在發(fā)揮著作用[22]。DSH基因是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，可能也有其他的功能，DSH是Wnt信號(hào)的關(guān)鍵因素，這些信號(hào)來(lái)源于Wnt受體家族，即卷曲蛋白。DSH能指揮來(lái)自于細(xì)胞質(zhì)膜的信號(hào)進(jìn)入正確的細(xì)胞內(nèi)通路[23]。VANGL基因是PCP通路中第一個(gè)確定與人類(lèi)NTDs有關(guān)的基因，并且有VANGL1和VANGL2兩個(gè)亞型。非洲爪蟾同源人類(lèi)VANGL1和VANGL2負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt β-catenin信號(hào)通路，編碼Wnt受體β信號(hào)通路負(fù)調(diào)控基因的功能突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[24]。FMI基因也是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，并且與PCP通路相關(guān)，F(xiàn)MI基因在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著很重要的作用[25]。Chen 等人[26]對(duì)184例中國(guó)NTDs病人的基因分析，他們發(fā)現(xiàn)3個(gè)CELSR基因(CELSR1,CELSR2 和CELSR3)發(fā)揮重要作用，這3個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致NTDs患病的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。PK基因在細(xì)胞層影響VANGL1的不對(duì)稱(chēng)動(dòng)力學(xué)，因此，PK基因控制自己的定位與VANGL1產(chǎn)生共同的影響[27]。DGO蛋白在脊椎動(dòng)物上的同源物是DVL，而DVL與Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路都有關(guān)[28]，目前在NTDs上研究不多，這些基因都是與PCP信號(hào)通路有關(guān)。還有一些基因在神經(jīng)管閉合這一過(guò)程中也起著比較重要的作用，例如SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等[7]發(fā)現(xiàn)在PIP5KL缺失的小鼠中，神經(jīng)管閉合有缺陷，而且神經(jīng)上皮排列混亂。

3 PCP信號(hào)通路與NTDs

已知PCP信號(hào)通路核心基因?qū)TDs的重要性，但除此之外，還有許多基因也對(duì)神經(jīng)管的閉合有著很重要的作用，例如：SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等人[7]發(fā)現(xiàn)在PIP5KL缺失的小鼠中，神經(jīng)管閉合有缺陷，而且神經(jīng)上皮排列混亂。下面對(duì)SHROOM3，VANGL2和WNT5A這三個(gè)基因是如何影響PCP信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致NTDs的發(fā)生進(jìn)行闡述。

Jeffrey等[29]對(duì)小鼠的SHROOM3基因研究發(fā)現(xiàn)，SHROOM3基因的嚴(yán)重突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的大腦畸形。因此，SHROOM3基因可能對(duì)神經(jīng)管閉合過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的因素。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中它SHROOM3基因的正常表達(dá)是神經(jīng)管形成的必要因素，該基因在進(jìn)化上是保守的。在該研究中，SHROOM3基因的功能的喪失會(huì)導(dǎo)致小鼠發(fā)生無(wú)腦畸形、腦膨出、脊柱裂等畸形，說(shuō)明神經(jīng)管閉合失敗。其原因是SHROOM3的功能喪失會(huì)使神經(jīng)折疊結(jié)構(gòu)向外部擴(kuò)展而不能在背側(cè)中線處匯合成。SHROOM3編碼一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，并且從多層次來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。首先，內(nèi)源性SHROOM3蛋白黏附于細(xì)胞骨架上；第二，局部表達(dá)的SHROOM3蛋白改變纖維肌動(dòng)蛋白的分布，并且該蛋白質(zhì)可以與纖維肌動(dòng)蛋白結(jié)合；第三，SHROOM3蛋白直接結(jié)合肌動(dòng)蛋白；最后，神經(jīng)上皮的細(xì)胞骨架會(huì)影響突變體的胚胎[30]。SHROOM3基因的缺失會(huì)阻斷神經(jīng)胚的形成，導(dǎo)致神經(jīng)管閉合失敗，由此引發(fā)的神經(jīng)管閉合缺陷并不能通過(guò)葉酸補(bǔ)充來(lái)預(yù)防，反而大劑量的補(bǔ)充會(huì)增高死亡率。目前，SHROOM3基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮功能的機(jī)制尚不清楚。除了SHROOM3基因之外，Chen和他的團(tuán)隊(duì)[31]對(duì)NTDs的病人研究發(fā)現(xiàn)，SHROOM2基因的突變會(huì)破壞PCP信號(hào)通路，進(jìn)而改變細(xì)胞骨架后重塑導(dǎo)致NTDs風(fēng)險(xiǎn)增加。

VANGL2基因是1988年Taylo[32]在從果蠅的基因組發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)表型不同，最先發(fā)現(xiàn)的基因而被命名為STBM或VANGL2。隨著研究的深入，Kibar和他的同事[33]推測(cè)人類(lèi)的NTDs由VANGL1及VANGL2基因突變引起的，這兩個(gè)基因在小鼠中與平面細(xì)胞極性有關(guān)。在NTDs患者中發(fā)現(xiàn)了很多種VANGL2基因突變，證實(shí)了NTDs的發(fā)生與VANGL2基因有密切的關(guān)系[34]。在脊椎動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，CE驅(qū)動(dòng)胚胎軸和神經(jīng)板的收縮和延長(zhǎng)。在幾種模式生物的原腸胚中，VANGL2在CE過(guò)程中起著決定性的作用[35]。Park等人[36]發(fā)現(xiàn)在爪蟾胚胎中過(guò)表達(dá)VANGL2能夠抑制CE的發(fā)生。如果在這一過(guò)程中VANGL2基因發(fā)生嚴(yán)重突變，可能導(dǎo)致高度組織特異性的上皮結(jié)構(gòu)失去正常的極性，從而導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)管缺陷的發(fā)生。Gabriel L Galea和他的團(tuán)隊(duì)[37]在VANGL2突變的純合小鼠中發(fā)現(xiàn)，VANGL2的突變阻止了小鼠神經(jīng)管的正常閉合，導(dǎo)致了NTDs的發(fā)生。因此，闡明VANGL2基因在神經(jīng)管閉合的過(guò)程中的分子作用機(jī)制，才能有效的預(yù)防或者阻止NTDs的發(fā)生。

1999年，Yamaguchi等[38]發(fā)現(xiàn)WNT5A基因的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎在發(fā)育過(guò)程出現(xiàn)差錯(cuò)從而導(dǎo)致新生兒的死亡。Shimizu[39]發(fā)現(xiàn)，在果蠅中WNT基因作用于PCP信號(hào)通路的上游。Wnt信號(hào)通路非常保守，且與神經(jīng)管畸形密切相關(guān)。Kimura-Yoshida等[7]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)調(diào)制器DKK1和KREMEN1定位在神經(jīng)板邊界。Kilian等人[40]發(fā)現(xiàn)WNT5A是后內(nèi)胚層如脊索中CE過(guò)程所需要的。Mcgreevy等[41]發(fā)現(xiàn)WNT5A是PCP通路中的一個(gè)配體，在WNT5A敲除的小鼠中呈現(xiàn)特有的CE過(guò)程，WNT5A和SHROOM3在遺傳上是相互作用的。2017年對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，PCP通路的一些組分會(huì)調(diào)節(jié)WNT5A，使皮質(zhì)脊髓軸突成長(zhǎng)成圓錐細(xì)胞[5]。

4 NTDs動(dòng)物模型

NTDs的致病原因相當(dāng)復(fù)雜，與單基因控制的疾病不同，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于NTDs。在遺傳因素中，雖然發(fā)現(xiàn)了許多基因與神經(jīng)管閉合有關(guān)，但是這些基因具體如何發(fā)揮作用導(dǎo)致NTDs尚不清楚。建立合適的動(dòng)物模型是探究相關(guān)基因及信號(hào)通路、營(yíng)養(yǎng)因素等與NTDs相關(guān)性的重要手段。

表1 主要NTDs動(dòng)物模型及相關(guān)基因

有關(guān)NTDs代表性動(dòng)物研究模型構(gòu)建見(jiàn)表1。從表中我們可以得出目前大部分研究NTDs的動(dòng)物模型都集中在小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚(yú)等低等模式動(dòng)物。因?yàn)镹TDs的發(fā)生是在神經(jīng)發(fā)育早期發(fā)生的，用其他的模式動(dòng)物很難觀察到神經(jīng)管閉合的過(guò)程。而上述三種動(dòng)物模型則可以很清楚和直觀的觀察到神經(jīng)管閉合過(guò)程中的變化，并且敲除這些動(dòng)物的與NTDs相關(guān)的基因很容易實(shí)現(xiàn)，因此很多科學(xué)家用這些動(dòng)物來(lái)研究NTDs。在這些研究模型中，很多研究的基因是PCP信號(hào)通路中的主要基因，也有其它一些重要基因如SHROOM3，TRPM6，和PAX3等基因。在表中的這些基因都與神經(jīng)管閉合的過(guò)程中的PCP信號(hào)通路以及CE過(guò)程有著很重要的關(guān)系。由于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，這些動(dòng)物模型的建立更加容易，但是也存在一些局限性。小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚(yú)的大腦發(fā)育有著很大的差別，一些基因表達(dá)的時(shí)間和空間也不盡相同。對(duì)于人類(lèi)NTDs來(lái)說(shuō)，這些模式動(dòng)物的大腦發(fā)育和人類(lèi)大腦發(fā)育有著天壤之別。在這些模式動(dòng)物中，某些與NTDs相關(guān)基因的突變可以導(dǎo)致它們發(fā)生神經(jīng)管閉合不全，但是這些結(jié)果不一定在人類(lèi)上可以發(fā)生。由于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的大腦和人發(fā)育的相似度很高，所以研究人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物是最好的選擇。但是由于嵌合體的問(wèn)題，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物上產(chǎn)生人類(lèi)NTDs有著很大的難題。因此，研究與人類(lèi)大腦發(fā)育及其相似的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型迫在眉睫。

5 問(wèn)題與展望

本文通過(guò)SHROOM3，VANGL2和WNT5A三個(gè)基因來(lái)闡明PCP信號(hào)通路在神經(jīng)管缺陷中的一些作用和和分子機(jī)制。在正常的發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞表達(dá)SHROOM3蛋白，產(chǎn)生的蛋白使細(xì)胞呈楔型，并且變長(zhǎng)，引起神經(jīng)板卷曲。還有一些細(xì)胞如附近的皮膚和表皮細(xì)胞等，則推動(dòng)和形成折疊，從而促使神經(jīng)管的閉合。VANGL2基因參與了CE這個(gè)過(guò)程，而CE又是PCP信號(hào)通路的一個(gè)重要組成部分，因此VANGL2基因的突變也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管的閉合不全。而WNT5A基因作用與PCP信號(hào)通路的上游來(lái)參與神經(jīng)管閉合這一過(guò)程，但是WNT5A基因突變不一定會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷的發(fā)生。

目前世界各國(guó)采用給育齡婦女補(bǔ)充FA來(lái)預(yù)防NTDs的發(fā)生，雖然達(dá)到了一定的預(yù)防效果，但還是不能阻止NTDs的發(fā)生。問(wèn)題在于NTDs的致病原因復(fù)雜，而且與之相關(guān)的基因較多。補(bǔ)充葉酸可以預(yù)防由VANGL2基因突變導(dǎo)致的NTDs，但是還有很多基因的突變導(dǎo)致的NTDs是葉酸所不能預(yù)防的。近年來(lái)，很多科學(xué)家都投入到研究NTDs的工作中，雖然取得了很大的成功，但是離治療還有很大一段路要去探索。目前研究的NTDs的動(dòng)物模型只有小鼠，大鼠和斑馬魚(yú)等模式生物，這些動(dòng)物模型只能幫助了解和探索NTDs的發(fā)病機(jī)制和作用機(jī)理。但是，這些動(dòng)物模型與人類(lèi)的發(fā)育有著很大的差別，因此建立非人靈長(zhǎng)類(lèi)NTDs模型至關(guān)重要，而且一個(gè)成功的NTDs非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型對(duì)發(fā)現(xiàn)新的治療方法和預(yù)防NTDs的發(fā)生有著十分重要的意義。