楊 赟，王智強，王蘊紅

(1.首都體育學院 研究生部，北京 100191； 2.首都體育學院 運動科學與健康學院，北京 100191)

miRNAs是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，它通過降解目的mRNA 或抑制其翻譯，調(diào)節(jié)目的基因表達，進而影響細胞的功能[1]。研究顯示，miRNAs參與了心臟發(fā)育、血管生成、心肌肥大、心力衰竭、再灌注損傷等生理病理過程的調(diào)節(jié)，且可能是關(guān)鍵性的調(diào)控因子之一[2-3]。 miRNA-30是miRNAs中的一種，包含miRNA-30a、b、c、d、e。在心肌組織中miRNA-30a有較高表達[4]，它對自噬相關(guān)基因的表達起重要的調(diào)控作用。有研究表明，IncRNA AK088388是長鏈非編碼RNA的一種，它作為內(nèi)源性RNA能夠通過競爭性結(jié)合miRNA-30a提高Beclin-1和LC3的表達，進而調(diào)控心肌細胞自噬水平[5]。也有研究表明當miRNA-30a表達升高時，Beclin-1 mRNA表達受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導的心肌肥大模型中，miRNA-30a的表達受到抑制，而Beclin-1 mRNA表達提高，自噬加強[6]。提示在心肌存在著AngⅡ?qū)iRNA-30a表達的調(diào)控，進而對心肌自噬產(chǎn)生調(diào)控的機制。而在運動模型的研究中發(fā)現(xiàn)，運動應激也可誘發(fā)心肌AngⅡ表達升高[7]和心肌自噬水平的變化。因此我們推測，在急性運動中，伴隨運動心肌的適應性變化，運動心肌miRNA-30a的表達也可能發(fā)生變化，且可能通過AngII對miRNA-30a的作用，影響心肌的自噬過程。所以我們通過建立大鼠一次急性運動模型，測定急性運動后不同時間心肌miRNA-30a以及自噬相關(guān)指標的表達變化，探討在急性運動應激狀態(tài)下運動心肌miRNA-30a的表達規(guī)律及其對自噬的調(diào)控機制，為進一步研究運動應激對該信號通路的調(diào)控作用進行初步探究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性SPF級SD大鼠24只，體重240～270 g，由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0011]。所有大鼠在北京體育大學動物房內(nèi)飼養(yǎng)和訓練[SYXK(京)2016-0033]，所有大鼠自由飲食，室溫為(22±20℃，空氣濕度為45%～55%，晝夜明暗交替時間12 h，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。本研究所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2016033)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

miRNA-30a-3p和miRNA-30a-5p引物試劑盒由Thermo Fisher提供，試劑和引物貨號如下：MirVanaTMRNA抽提試劑盒，REF：AM1556、TaqManTMMicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，REF：4366596(has-miR-30a-3p,Assay ID:000416、has-miR-30a-5p,Assay ID:000417、U6 snRNA,Assay ID；001973)、TaqManTMUniversal Master Mix II預混液，REF： 4440038、SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)，REF：18080051、SYBRTMSelect Master Mix預混液，REF：4472908。

六跑道動物實驗跑臺(ZS-PT-Ⅲ型，中國)；梯度PCR儀(Mastercycler Nexus，德國Eppendorf)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(7500Fast，美國ABI)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

所有大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為安靜對照組(Con)，運動后0 h組(E0)，運動后3 h組(E3)和運動后12 h組(E12),每組6只。急性運動方案：跑臺坡度為16°，速度16 m/min，運動時間為1 h。運動組運動后按時間點取材，安靜組同時取材。左心室肌組織用預冷的DEPC水處理后投入液氮速凍，-80℃保存。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應

Ambion試劑盒抽提心肌細胞總RNA，通過Bulge-LoopTM RT Primer反轉(zhuǎn)錄，采用TaqMan熒光探針法進行qRT-PCR檢測miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p，U6 為內(nèi)參照。20 μL反應體系包括：2× PCR mix10 μL、20×引物1 μL、cDNA 1.5 μL和7.5 μL DEPC水。實時定量反應：預變性50℃ 2min，95℃ 10 min。95℃ 15 s，60℃ 60 s，45個循環(huán)。常規(guī)Trizol方法抽提心肌細胞總RNA，通Bulge-LoopTM RT Primer反轉(zhuǎn)錄，采用 SYBR Green 進行常規(guī)qRT-PCR，檢測心肌血管轉(zhuǎn)化酶(ACE)、Beclin-1和LC3，GAPDH為內(nèi)參照，各引物序列見表1。反應體系包括2× SYBR 6 μL、Rox 0.2 μL、cDNA 1.5 μL、10μmol/L P1+P2 1 μL、DEPC水6 μL。反應參數(shù)：95℃ 30 s，95℃ 3 s、60℃ 30 s，45個循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。實驗重復三次，3p、5p、U6、Beclin-1、LC3和GAPDH產(chǎn)物倍數(shù)按2-ΔΔCt計算。

表1 引物和內(nèi)參序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 運動后不同時間大鼠心肌miR-30a表達

與安靜對照組相比，運動后0 h組心肌miRNA-30a-3p和miRNA-30a-5p表達都顯著性增高(P<0.05)，運動后3 h組和12 h組與安靜組相比沒有顯著性差異(見圖1)。

注：與對照組相比，*P<0.05。圖1 運動后大鼠心肌miRNA-30a表達Note. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 1 Post-exercise myocardial miRNA-30a-3p and miRNA-30a-5p expression in the rats

2.2 運動后不同時間大鼠心肌ACE mRNA表達

與安靜對照組相比，運動后0 h組心肌ACE mRNA表達顯著性增高(P<0.05)，運動后3 h組和12 h組與安靜組相比沒有顯著性差異(見圖2)。

注：與對照組相比，*P<0.05。圖2 運動后大鼠心肌ACE mRNA表達Note. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 2 Post-exercise myocardial ACE mRNA expression in the rats

2.3 運動后不同時間大鼠心肌Beclin-1 mRNA的表達

與安靜對照組相比，運動后0 h組心肌Beclin-1 mRNA的表達顯著性提高(P<0.05)，在運動后3 h逐漸恢復到安靜狀態(tài)(見圖3)。

注：與對照組相比，*P<0.05。圖3 運動后不同時間大鼠心肌Beclin-1 mRNA表達Note. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 3 Post-exercise myocardial Beclin-1 mRNA expression in the rats

2.4 運動后不同時間大鼠心肌LC3 mRNA的表達

與安靜對照組相比，運動后0 h組心肌LC3 mRNA的表達均顯著性提高(P<0.05)，在運動后3 h逐漸恢復到安靜狀態(tài)(見圖4)。

注：與對照組相比，*P<0.05。圖4 運動后大鼠心肌LC3 mRNA的表達Note. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 4 Post-exercise myocardial LC3 mRNA expression in the rats

3 討論

成熟的心肌細胞是終末分化的細胞，因此，其細胞器和蛋白質(zhì)質(zhì)量的維持，對實現(xiàn)心肌細胞的正常功能起重要的作用。自噬是細胞溶酶體降解受損、衰老細胞器和蛋白質(zhì)等內(nèi)源性底物的重要過程。在心肌重塑過程中，適宜的自噬是對刺激因素適應和自我保護的反應，但過度自噬則可能導致心肌細胞凋亡[8]。

研究顯示，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)參與了心肌重塑過程，而用黃芪多糖可有效抑制血管緊張素II誘導的心肌細胞肥大[9]。在血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚模型中，Beclin-1和LC3在基因和蛋白水平表達均明顯提高，并且當Beclin-1 mRNA過度表達時，與心肌肥厚有關(guān)基因表達也增強；而緘默Beclin-1基因,則引起與心肌肥厚有關(guān)基因表達下調(diào)，提示血管緊張素Ⅱ參與了Beclin-1 mRNA 表達的調(diào)控過程[6]。在大鼠急性力竭運動模型中發(fā)現(xiàn)運動后心肌局部AngII的含量降低了43%，血漿AngII的含量增加了83%[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，長期游泳訓練造成的心肌肥大大鼠，心肌局部AngII含量顯著升高[7]。提示運動誘發(fā)心肌AngII釋放可能與心肌Beclin-1 mRNA 表達升高有密切關(guān)系。本研究進一步顯示，急性運動后心肌ACE mRNA顯著性升高，由于ACE是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，編碼的蛋白可以將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有調(diào)節(jié)血管張力和血管平滑肌增生的血管緊張素II[11]。推測運動后心肌ACE mRNA表達升高與運動心肌AngII的更新變化有關(guān)。

已有研究表明，急性運動也可提高心肌自噬水平，使Beclin-1和LC3蛋白表達升高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動后即刻心肌Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA的表達顯著升高，進一步表明急性運動可以促進心肌自噬相關(guān)基因表達提高，導致了Beclin-1和LC3 II蛋白表達的提高。

miRNA-30a由Drosha和Dicer兩種RNA酶加工形成。Drosha酶將原始長鏈轉(zhuǎn)錄本加工成含有60-70個堿基的頸環(huán)結(jié)構(gòu)前體(包括相反的兩個臂“-3p”和“-5p”)然后由Dicer酶將其剪切為成熟的miRNAs[13-14]。由于Beclin-1是miRNA-30a的靶基因，miRNA-30a可以與Beclin-1的3’UTR結(jié)合來調(diào)控該基因[13]。miRNA-30a擬似劑處理心肌細胞后， Beclin-1 mRNA的表達下調(diào)，而用miRNA-30a抑制劑處理時，Beclin-1 mRNA表達上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞轉(zhuǎn)入miRNA-30a抑制劑損害miRNA-30a的功能時，能夠引起心肌肥厚相關(guān)的基因表達上調(diào)[7]，這些結(jié)果提示， miRNA-30a介導了Ang II誘導的心肌肥厚和自噬的過程。為此，我們測定了運動心肌miR-30a “-3p”和“-5p”表達的變化。結(jié)果進一步顯示，運動應激也能夠誘發(fā)miRNA-30a、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達，同時誘發(fā)ACE mRNA 表達的同步升高，提示在運動心肌中，Ang II 對Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達發(fā)揮調(diào)控作用。在急性運動中能夠同時誘發(fā)正、負調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達提高，而且這種暫時轉(zhuǎn)錄水平的升高只發(fā)生在運動后即刻，而我們和其他研究者研究顯示，急性運動可引起B(yǎng)eclin-1蛋白表達的升高，提示這種運動應激引起miRNA-30a表達的升高，對于翻譯水平的調(diào)控不起決定性的作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明急性運動應激可以一過性的提高心肌ACE mRNA、miRNA-30a、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達，推測運動應激誘發(fā)miRNA-30a 對心肌Beclin-1 mRNA表達的調(diào)控作用可能是一過性的，具體調(diào)控情況還需要通過藥物干預或基因阻斷模型進一步證實。